遺傳學實驗：實驗十 目的基因的克隆與鑒定

四、實驗步驟1連接：pMD18-T載體（Takara試劑盒）pMD18-T

Vector

1ulDNA4ulSolutionI5ul10ul加樣16℃30min2轉化:

全量(10ul)加入50ul感受態(tài)細胞中，冰上放置30min42℃90秒，冰上放置2min加入400ulLB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)60min3培養(yǎng)鑒定:

10000轉，離心2min，取200ul上清丟棄，其余混勻。取50ul涂板（IPTG,X-Gal,氨芐），37℃10-15小時觀察，白色菌斑為重組型。實驗十目的基因的克隆與鑒定實驗十、目的基因的克隆與鑒定一、實驗目的掌握目的基因片段連接、質(zhì)粒轉化、菌落培養(yǎng)鑒定方法。為基因測序和其它研究和應用準備高質(zhì)量的基因片段。連接:回收目的基因片段同克隆載體連接轉化:將重組載體導入細菌篩選:通過抗性基因和顯色反應選擇重組載體回收:在細菌中大量繁殖重組載體并回收鑒定:菌落和重組載體是否含目的基因片段實驗流程二、實驗原理1、連接Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A；T載體是一種帶有3’T突出端的載體；在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（MCS）中。

高效克隆PCR產(chǎn)物（TACloning）的專用載體2、轉化細胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法,化學試劑法（CaCl2)等的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。3、鑒定--

α-互補質(zhì)粒載體帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。宿主細胞存在可編碼β-半乳糖苷酶C端部分的序列。它們同時存在時，能恢復lacZ酶的活性，稱為α-互補。在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落，因而易于識別。當外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。三、實驗材料1連接：

基因：菠菜actin基因的部分序列（純化的PCR產(chǎn)物）

載體：pMD18-T載體。（Takara試劑盒）2轉化

重組質(zhì)粒（上步結果）

感受態(tài)細胞DH5α（天根生物）

液體SOC培養(yǎng)基（或LB培養(yǎng)基）3鑒定LB固體培養(yǎng)基（IPTG,X-Gal,氨芐）

四、實驗步驟1連接：pMD18-T載體（Takara試劑盒）pMD18-T

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1ulDNA4ulSolutionI5ul10ul加樣16℃30min2轉化:

全量(10ul)加入50ul感受態(tài)細胞中，冰上放置30min42℃90秒，冰上放置2min加入400ulLB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)60min3培養(yǎng)鑒定:

10000轉，離心2min，取200ul上清丟棄，其余混勻。取50ul涂板（IPTG,X-Gal,氨芐），37℃