第一章 微生物檢驗(yàn)鑒定技術(shù)

第一章微生物檢驗(yàn)

鑒定技術(shù)

本章提綱第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)與操作第二節(jié)微生物常規(guī)鑒定技術(shù)第三節(jié)食品微生物檢驗(yàn)新技術(shù)第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本

知識(shí)與操作

包括顯微鏡檢、染色技術(shù)、培養(yǎng)基制備技術(shù)、接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)等。第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)一、接種（inoculation）將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。１.接種工具

1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀Inoculation

istheplacementofsomethingtowhereitwillgroworreproduce,andismostcommonlyusedinrespectoftheintroductionofaserum,vaccine,orantigenicsubstanceintothebodyofahumanoranimal,especiallytoproduceorboostimmunitytoaspecificdisease;butalsocanbeusedtorefertothecommunicationofadiseasetoalivingorganismbytransferringitscausativeagentintotheorganism,toimplantmicroorganismsorinfectiousmaterialintoaculturemediumsuchasabrewersvatorapetridish.第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)一、接種2.常用的接種方法有以下幾種：１）劃線接種

最常用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。２）三點(diǎn)接種在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀察、研究它們的形態(tài)。３）穿刺接種在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常用。用的接種工具是接種針。培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基４）傾注接種

該法是將待接種微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，以達(dá)到稀釋菌液的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)一、接種2.常用的接種方法５）涂布接種先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，使菌液均勻分布，即可長(zhǎng)出單個(gè)菌落。６）液體接種從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中；或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，都屬于液體接種。７）注射接種用注射的方法將微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種。８）活體接種是專用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式有注射、灌喂、拌料喂養(yǎng)等。第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)一、接種3.無(wú)菌操作(Aseptictechnique)

培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。

AseptictechniqueAseptictechniqueisasetofspecificpracticesandproceduresperformedundercarefullycontrolledconditionswiththegoalofminimizingcontaminationbypathogens.Purpose:Aseptictechniqueisemployedtomaximizeandmaintainasepsis,theabsenceofpathogenicorganismsintheclinicalsettingandtopreventthespreadofpathogens.Often,practicesthatclean(removedirtandotherimpurities),sanitize(reducethenumberofmicroorganismstosafelevels),ordisinfect(removemostmicroorganismsbutnothighlyresistantones)arenotsufficienttopreventinfection.針尖上的細(xì)菌第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化（Isolation）含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixedculture）。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（Pureculture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱為分離純化，方法有許多種。第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化１、傾注平板法(Pourplate)第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化２、涂布平板法,

Spreadplate

第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化３、平板劃線法,Streakplate

常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

Streak

plate

第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化４、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它微生物。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。通過(guò)多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化５、厭氧法在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把它放在沸水浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無(wú)菌石蠟于培養(yǎng)基表面，使與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。

第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)三、培養(yǎng)

1、根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)。好氧培養(yǎng)(AerobicIncubation)

：也稱“好氣培養(yǎng)”。厭氧培養(yǎng)(AnaerobicIncubation)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。第一節(jié)微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)三、培養(yǎng)

２、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。

固體培養(yǎng)：solidincubation

液體培養(yǎng)：liquidincubation第二節(jié)微生物常規(guī)

鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察二、生理生化試驗(yàn)三、血清學(xué)試驗(yàn)第二節(jié)微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。

2、微生物培養(yǎng)特性觀察E.Coli(G-)綠膿桿菌單鞭毛S.aureus(G+)梭狀芽孢桿菌曲霉青霉酵母炭疽芽孢革蘭染色法，丹麥病理學(xué)家C.Gram創(chuàng)立（1884）

（1）涂片：（2）晾干：（3）固定（4）結(jié)晶紫色染色：1min。水洗（5）媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。水洗（6）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20~25s至流出液無(wú)色，立即水洗。（7）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。水洗（8）晾干：晾干或者用吸水紙吸干。（9）鏡檢：先用低倍，再用高倍，最后用油鏡。（10）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：①浸過(guò)油的鏡頭：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2~3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2~3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。②細(xì)菌染色玻片用廢擦鏡紙將香柏油擦干Gram’sstaining第二節(jié)微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察2、微生物培養(yǎng)特性觀察微生物培養(yǎng)特性的觀察是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

１）細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。

細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)性狀觀察

A.深濁度：觀察是否透明、輕度渾濁、中度渾濁或極度渾濁，還有均勻渾濁、顆粒狀渾濁、絮狀渾濁。

B.沉淀：試管底有無(wú)沉淀，沉淀物呈顆粒狀、粘稠狀或絮狀。輕搖時(shí)云霧狀、絮狀或發(fā)辮狀升起。

C.表面：有無(wú)菌膜及附著于管壁的菌環(huán)

D.色素及氣味

細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)性狀觀察

A.大?。壕渲睆皆?mm以下為露滴狀菌落；1-2mm為小菌落；2-4為中等大菌落；4-6mm或更大為大菌落。

B.形狀：有圓形，有規(guī)則形、根足形、菌絲狀等

C.邊緣：有整齊、鋸齒狀、纖毛狀、卷發(fā)狀等

D.表面：有光滑、濕滑、粗糙、顆粒狀、皺絲狀、同心狀、放射狀等

E.降起度：有角平、隆起、臍狀、扭扣狀

F.顏色：有無(wú)色、白色、灰白色、金黃色、檸檬色、綠色、紅色等

G.透明度：有透明、半透明、不透明等一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察2、微生物培養(yǎng)特性觀察１）細(xì)菌的培養(yǎng)特征２）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。

霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無(wú)限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。第二節(jié)微生物常規(guī)鑒定技術(shù)二、生理生化試驗(yàn)微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。

微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：

糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)V-P試驗(yàn)甲基紅（MR）試驗(yàn)靛基質(zhì)（Indole）試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)明膠液化試驗(yàn)?zāi)蛩孛福║rease）試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)硫化氫（H2S）試驗(yàn)三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)氨基酸脫羧酶的測(cè)定耐鹽性試驗(yàn)卵磷脂酶的測(cè)定石蕊牛奶反應(yīng)酪蛋白水解苯丙氨酸脫氨試驗(yàn)氰化鉀試驗(yàn)對(duì)疊氮化鈉的抗性硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗(yàn)含碳化合物的利用（檸檬酸鹽或丙酸鹽利用）BiochemicalandMetabolicPropertiesofMicrobesMicroorganismscanbeclassified,ordistinguishedfromoneanother,bytheabilityto(1)growondifferentsubstratesand/orproductionofdifferentendproducts,(2)producespecificenzymes,(3)useoxygen,or(4)bemotile.Forexample,certainmicrobescanusedifferentcarbohydratesassourcesofenergyand/orcarbon.Becausesuchvariabilityexistsincarbohydrateutilizationbetweendifferentmicrobes,thiscanaidinthegroup,genus,orspeciesidentification.第二節(jié)微生物常規(guī)鑒定技術(shù)三、血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來(lái)鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。

在細(xì)菌的檢測(cè)中，應(yīng)用最多的是凝集試驗(yàn)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。SerologicaltestingSerologyisamedical

bloodtesttodetectthepresenceofantibod