用掃描電鏡觀察大腸桿菌的幾種方法

用掃描電鏡觀察大腸桿菌的幾種方法

用傳統(tǒng)方法制作微生物掃描電鏡樣品通常需要固定、清潔、脫水、干燥、粘合樣品、金屬等步驟。最后，樣品可以放在電鏡下觀察。對(duì)于外表有細(xì)胞壁的微生物,如大腸桿菌,因細(xì)胞壁不易變形,即使不固定也能保持菌體形態(tài),因而有人主張省略固定步驟。常規(guī)清洗方法是用磷酸緩沖液作清洗劑;對(duì)于脫水和干燥,有人認(rèn)為大腸桿菌是單細(xì)胞,容易干燥,因此不必經(jīng)過(guò)繁雜的程序,只需將細(xì)菌懸液滴在樣品臺(tái)上,在室內(nèi)晾干即可鍍金觀察。筆者為消除廣大研究者的困惑,確定一套簡(jiǎn)潔有效的微生物掃描電鏡制樣方案,采用多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌,用HitachiS-3000N掃描電鏡分別觀察比較該菌的固定與不固定,用磷酸緩沖液或蒸餾水清洗,冷凍干燥、室內(nèi)晾干和烘箱干燥后的形態(tài)和制樣處理效果。1材料和方法1.1材料表面大腸桿菌JM109;LB培養(yǎng)基:酵母提取物、氯化鈉、瓊脂、胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2非熱利用技術(shù)S-3000N掃描電子顯微鏡、ES2030冷凍干燥機(jī)、E-1010離子濺射儀,日本Hitachi公司;D-1自動(dòng)蒸汽滅菌鍋,北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司;SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器,金壇市杰瑞爾電器有限公司;AIRTECH超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)安泰公司;TGL-G高速臺(tái)式離心機(jī),上海醫(yī)療器械廠;HPX-9082MBE數(shù)字電熱培養(yǎng)箱,上海博風(fēng)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠。1.3方法1.3.1液體培養(yǎng)基將需用器具和培養(yǎng)基滅菌,取玻璃試管若干,注入5ml液體培養(yǎng)基。從平板上挑取新活化的大腸桿菌單菌落,接種到各試管培養(yǎng)基中,37℃200r/min振蕩培養(yǎng)12h。1.3.2菌株的n轉(zhuǎn)離心用膠頭滴管吸取細(xì)菌培養(yǎng)液,注入到不同的離心管中,兩兩平衡,以3000r/min轉(zhuǎn)速離心5min后,去除培養(yǎng)基上清。在一組有大腸桿菌沉淀的離心管中注入40倍菌體體積的2.5%戊二醛,混勻后靜置2h以上固定。另一組大腸桿菌沉淀不固定,用水清洗3遍,每次10min,清洗完畢用蒸餾水重懸,滴在樣品臺(tái)的蓋玻片上40℃烘干。1.3.3樣品處理和清洗取部分固定后的大腸桿菌分3組,第1組先用3000r/min轉(zhuǎn)速離心5min,將細(xì)菌沉積,棄上清固定液,將pH值調(diào)至7.2的0.02mmol/LPBS注入離心管混勻,再以相同轉(zhuǎn)速離心5min,去上清,重復(fù)3次,以(磷酸鹽緩沖液)PBS重懸;第2組以蒸餾水代替PBS清洗,所有操作均相同,最后以蒸餾水重懸;第3組不清洗,仍懸浮于原固定液中;分別用不同滴管吸取各自菌液,滴在樣品臺(tái)的蓋玻片上。另取3個(gè)粘有蓋玻片的樣品臺(tái),分別滴加蒸餾水、2.5%戊二醛和0.02molpH值為7.2的PBS。將以上各組樣品放在干燥箱中40℃烘干。1.3.4細(xì)菌和桿菌的制備取部分固定后的大腸桿菌按上述方法用蒸餾水清洗3遍,然后分別用30%、50%、70%、80%、90%梯度濃度酒精脫水,每個(gè)梯度中靜置10min,脫水完畢,用純酒精脫水3次,每次30min,然后用純叔丁醇置換酒精3次,每次30min,最后吸取混勻的細(xì)菌-叔丁醇懸浮液滴在覆有蓋玻片的樣品臺(tái)上,置-10℃預(yù)冷的冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空干燥,氣壓表指示10Pa以下時(shí)取出。第2組固定后的大腸桿菌則用蒸餾水清洗3遍后放在室內(nèi)自然風(fēng)干;第3組固定的大腸桿菌用蒸餾水清洗3遍,置烘箱中40℃烘干。1.3.5pa真空度的測(cè)定將以上各組干燥脫水后的大腸桿菌放在鍍膜儀內(nèi),以10Pa的真空度,15mA的離子電流鍍金160s。在掃描電鏡下取7.0mm的工作距離,66μA的燈絲電流,15kV的加速電壓觀察大腸桿菌并拍照。2結(jié)果與分析2.1固定對(duì)觀察效果的影響由圖1A、B可知,不固定的細(xì)菌周?chē)蟹置谖锒潭ǖ臎](méi)有。2.2覆蓋液制備pbs由圖2A～F可知,蒸餾水滴在玻片上,干燥后無(wú)雜質(zhì)殘留;玻片上的戊二醛溶液干燥后形成了晶體;PBS滴在玻片上,干燥后留下了顆粒層;用水清洗樣品后無(wú)雜質(zhì)覆蓋;用戊二醛固定后不清洗,干燥后有一層膜覆蓋遮蔽樣品;用PBS清洗細(xì)菌,干燥后可見(jiàn)留下的磷酸鹽顆粒將部分樣品埋沒(méi)。2.3樣品的制備圖3A～C是用不同干燥方法處理樣品后的圖像,其中A是滴在玻片上自然風(fēng)干的樣品;B是40℃烘2d的樣品;C是固定后以蒸餾水清洗,酒精脫水,叔丁醇置換酒精冷凍干燥的樣品?？梢?jiàn),干燥越充分圖像越清晰。3樣品的固定和干燥(1)細(xì)菌和其他生物樣品必須脫水干燥才能在掃描電鏡下觀察。細(xì)菌等生物樣品在脫水死亡過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)各種成分會(huì)變性和酶解,受脫水和不利溶液的刺激,細(xì)菌會(huì)分泌內(nèi)含物。固定劑可抑制這些變化。戊二醛分子上有2個(gè)對(duì)稱(chēng)的醛基,能分別與蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等共價(jià)結(jié)合,將蛋白質(zhì)分子上不同氨基酸殘基上的氨基、酚基交聯(lián)而起固定作用。除脂質(zhì)外,戊二醛還能固定糖原、核酸、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。不過(guò)濃度要適宜,濃度過(guò)高會(huì)造成組織收縮,過(guò)低則不能及時(shí)的固定組織。大腸桿菌外層的細(xì)胞壁具有一定硬度和剛性,不易變形,能使細(xì)胞保持一定形狀和在不同滲透壓下生長(zhǎng),在不利環(huán)境下還能防止溶胞。因此不固定也可保持細(xì)菌較完好的外觀形態(tài)。但干燥過(guò)程的刺激可能誘使細(xì)菌分泌內(nèi)部物質(zhì)到外周,導(dǎo)致圖像背景不潔。(2)為顯露樣品被觀察的部位,清洗是必要的。戊二醛在水溶液中多為環(huán)狀水合物,干燥后會(huì)形成有形晶體;PBS由NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4加水配成,干燥后也會(huì)留下細(xì)微的顆粒覆蓋在樣品表面遮蔽樣品。因此,作者建議樣品在固定后,要用水或乙醇、丙酮等干燥后無(wú)殘留的試劑清洗。乙醇、丙酮會(huì)使樣品收縮,用蒸餾水清洗經(jīng)濟(jì)又方便;清洗樣品還可減少對(duì)電鏡內(nèi)腔的污染,延緩燈絲熔斷。(3)室內(nèi)晾干法受不同季節(jié)和氣候的溫度、濕度變化影響,不易脫去組織內(nèi)的水分。烘箱干燥法利用高溫加快水分蒸發(fā)而使樣品脫水。因?yàn)樗哂休^大的內(nèi)聚力和電極性,可與樣品中的極性成分瞬間結(jié)合,在揮發(fā)干燥時(shí)會(huì)牽動(dòng)樣品組分而造成樣品變形或微小斷裂。用酒精脫水是利用樣品內(nèi)外水和乙醇的濃度差形成的滲透壓差將樣品中的游離水置換出來(lái),酒精則滲到樣品內(nèi)。酒精極性小,易從樣品中揮發(fā)而使樣品脫水。冷凍干燥是先用叔丁醇在熔點(diǎn)以上