甲酸乙酯對米象乙酰膽堿酯酶活性的影響

甲酸乙酯對米象乙酰膽堿酯酶活性的影響

糧食儲備是合理利用糧食資源的重要手段之一。糧食在儲存過程中容易受到有害藥物的損害，導(dǎo)致糧食質(zhì)量和數(shù)量的巨大損失。藥劑熏蒸法是目前最為有效和經(jīng)濟(jì)的防治手段,熏蒸劑溴甲烷即將被淘汰、磷化氫抗性問題也日益嚴(yán)重,使得現(xiàn)在可選擇的藥劑品種越來越少,對糧食的安全儲藏提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。甲酸乙酯(ethylformate)是一種對環(huán)境友好的新型綠色熏蒸劑,在常溫下為無色液體,沸點(diǎn)為54.1℃,2002年甲酸乙酯作為處理干果的熏蒸劑在澳大利亞登記注冊。近年來,澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織(CSIRO)的科學(xué)家們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),甲酸乙酯作為糧食熏蒸劑具有以下優(yōu)點(diǎn):①殺蟲迅速,一般在2d內(nèi)就能發(fā)揮很好的殺蟲活性;②熏蒸后植物種子的品質(zhì)與發(fā)芽率不受影響;③甲酸乙酯會很快降解至自然水平,不會在儲藏物中殘留。因此,被廣泛認(rèn)為是一種很有潛力的糧食熏蒸劑。甲酸乙酯與CO2組成的液態(tài)混合熏蒸劑(VAPORMATETM)也已經(jīng)在澳大利亞注冊成功,關(guān)于甲酸乙酯應(yīng)用的其他劑型正在開發(fā)期間。米象[Sitophilusoryzae(Linnaeus)]隸屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae),是一種世界性的儲糧害蟲,嚴(yán)重危害各種谷物及種子、谷物加工品、豆類、油料、干果和藥材等。本文研究了甲酸乙酯亞致死劑量對米象體內(nèi)乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的影響,以期有助于闡明該藥劑的毒理機(jī)制和主要靶標(biāo)。1材料和方法1.1米象成蟲的人工養(yǎng)殖供試?yán)ハx米象由國家糧食儲備局成都糧食科學(xué)研究所提供,并在西南農(nóng)業(yè)大學(xué)重慶市昆蟲學(xué)及害蟲控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)蟲室內(nèi)人工飼養(yǎng)。將米象成蟲接種于經(jīng)Co60γ射線消毒過的小麥中,產(chǎn)卵7d后將成蟲篩去,后代在溫度為(30±1)℃,相對濕度為(75±5)%,24h黑暗的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。以羽化后7～14d的健康成蟲作為試蟲。1.2合成試劑及試劑甲酸乙酯(含量>98%)、α-萘酚(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn));乙酸-α-萘酯(α-NA)(中國上海青浦合成試劑廠);毒扁豆堿(Sigma公司);固藍(lán)B鹽、碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)、雙(4-硝基-3-羧基苯)二硫化物(DTNB)(Fluka公司);十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍(lán)G-250(AMRESCO分裝)。以上試劑均為分析純。UV-8500型紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。1.3廣口瓶生物培養(yǎng)法采用廣口瓶密閉熏蒸法。先將米象成蟲放于容量為1000mL的廣口瓶中,再將定量的甲酸乙酯滴在熏蒸盒(d=2cm,h=1cm)底部的濾紙上,然后迅速用尼龍紗布將盒子包好,置于廣口瓶內(nèi),蓋上瓶蓋,并用保鮮膜將瓶口密封。將廣口瓶置于事先設(shè)定好溫度的培養(yǎng)箱內(nèi),全黑暗條件下進(jìn)行熏蒸,24h藥劑濃度設(shè)定24、26、28、30、32、34μL/L6個梯度,48h設(shè)定濃度梯度為20、22、24、26、28、30、32μL/L,每個處理供試成蟲50頭,3次重復(fù),并設(shè)空白對照,在散氣24h后檢查記錄成蟲死亡數(shù)量。采用IRM害蟲抗藥性管理軟件進(jìn)行回歸分析,用幾率值法求出毒力回歸線和LC50。1.4乙酰膽堿酯酶ache活性測定1.4.1不同藥劑對ache酶活力的影響參照Ellman的方法。將米象成蟲置于1000mL的廣口瓶中,按照10、15、20μL/L的濃度加入甲酸乙酯,放置在25℃全黑暗的溫箱中,在熏蒸4、8、16h和24h后散氣,分別取存活的成蟲10頭,加入預(yù)冷的pH8.0、0.1mol/L的磷酸緩沖液1.5mL,于冰水浴中勻漿,勻漿液在4℃、10000g條件下離心20min,取上清液冰浴待測。用碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)(1.5mmol/L)作底物,經(jīng)AChE水解后生成硫代膽堿和乙酸,與顯色劑DTNB(1.0mmol/L)生成黃色物質(zhì),以毒扁豆堿(1×10-4mol/L)終止反應(yīng),在412nm處測其OD值,每處理重復(fù)3次,并測定酶液中蛋白質(zhì)含量。根據(jù)消光系數(shù)[e=1.36×10-4(mol/L)-1cm-1]將OD值換算成AChE的比活力(nmol/mg·min)。以酶活抑制率表示藥劑對酶活力的影響,酶活抑制率=(對照組酶活力-處理組酶活力)/對照組酶活力×100%。Km值測定的反應(yīng)總體積3.6mL,底物終濃度分別為0.005、0.02、0.1、0.5、2.0mmol/L。計(jì)算方法參照Wilkinson(1961)。1.4.2甲酸乙酯溶液配制取未用藥劑熏蒸過的米象成蟲,按與活體測定相同的方法提取酶液。以丙酮為溶劑,先將甲酸乙酯配成0.1、1、10mL/L和100mL/L的不同濃度,在反應(yīng)體系中預(yù)加入0.1mL上述4種濃度的藥液,再與酶液混合保溫,其他同活體測定。1.5丙烯酸酶care的活性測試1.5.1方面活性成分穩(wěn)定機(jī)理,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,三復(fù)制液、水液-液法。請看參照vanAspern的方法。試蟲處理同AChE活體測定,取10頭處理過的米象成蟲,加入預(yù)冷的pH7.0、0.04mol/L的磷酸緩沖液1.2mL,于冰浴條件下勻漿,勻漿液在4℃、10000g條件下離心15min,取上清液冰浴,稀釋3倍后測定CarE活性,母液用于測定蛋白質(zhì)含量。用α-萘酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以α-乙酸萘酯(α-NA)(3×10-4mol/L)作底物,經(jīng)羧酸酯酶水解后生成α-萘酚,與顯色劑V(1%堅(jiān)固藍(lán)B)∶V(5%SDS)=2∶5,可生成深藍(lán)色物質(zhì),在600nm處測OD值。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶原蛋白含量的測定結(jié)果,將OD值換算成比活力(μmol/mg·30min)。1.5.2酶液的提取取未熏蒸過的米象成蟲按與活體測定相同的方法提取酶液。藥劑與酶液的處理和AChE離體測定相似,再按與CarE活體測定相同的方法分別測定OD值,計(jì)算比活力。1.6測定蛋白質(zhì)含量參照Bradford考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定。2結(jié)果與分析2.1不同ph的保鮮劑對過多酚主動生長的效果甲酸乙酯對米象表現(xiàn)出很高的毒力,尤其在短時間內(nèi)就能發(fā)揮很好的殺蟲效果,在熏蒸處理24h后其LC50為28.650μL/L,處理48h后LC50為25.805μL/L(表1)。2.2乙酰膽堿酯的酶活性2.2.1合成纖維/雙環(huán)芳烴處理對ache比活力的影響活體條件下未用藥處理的米象成蟲體內(nèi)AChE活力變化較小,而處理試蟲的酶活性差異顯著,表現(xiàn)為抑制作用(表2)。在相同處理時間下隨著藥劑濃度的增大AChE的比活力逐漸降低,10μL/L的甲酸乙酯處理米象16h后,AChE的比活力由15.469nmol/mg·min降至13.288nmol/mg·min,而在20μL/L的濃度下處理時則降至9.264nmol/mg·min;在相同的藥劑濃度下隨著處理時間的延長AChE的比活力也逐漸降低,15μL/L的甲酸乙酯處理米象4h后AChE的比活力由15.452nmol/mg·min降至12.678nmol/mg·min,而處理24h后則由15.684nmol/mg·min降至10.663nmol/mg·min。2.2.2藥劑對ache活性的影響從表3可以看出,在離體條件下甲酸乙酯對米象AChE的活性影響較小,盡管藥劑處理后米象AChE活性略有提高,但與對照相比差異并不顯著,不同藥劑濃度造成AChE活性差異亦未達(dá)到顯著水平(p>0.05)。2.2.3改變ay酶促反應(yīng)動力學(xué)研究表明,用甲酸乙酯處理后米象成蟲體內(nèi)AChE的Km值明顯變大,15μL/L和20μL/L的甲酸乙酯處理8h使Km值從6.058×10-3mmol/L增大至8.069×10-3mmol/L和1.728×10-2mmol/L,表明甲酸乙酯的抑制降低了AChE對底物ATChI的親和力。2.3丙烯酸酶活性2.3.1藥劑濃度對力表4表明,用10、15、20μL/L的甲酸乙酯處理試蟲4h和8h后,米象體內(nèi)CarE的比活力均顯著低于對照,而不同藥劑濃度間差異不顯著(p>0.05)。當(dāng)處理時間增加至16h后,米象體內(nèi)CarE的比活力均高于對照,但其差異并不顯著(p>0.05)。當(dāng)處理時間延長到24h后,20μL/L的濃度下米象體內(nèi)CarE的比活力顯著低于對照(p<0.05),其他濃度與對照間差異不明顯。2.3.2甲醇乙酯溶液對甲醛乙酯抑制劑抑制率的影響離體條件下甲酸乙酯對米象CarE比活力有顯著抑制作用(p<0.05),且表現(xiàn)為在一定藥劑濃度范圍內(nèi),隨甲酸乙酯濃度的增高抑制能力增強(qiáng)的趨勢(表5)。0.1mL/L的甲酸乙酯對CarE比活力的抑制率為3.256%,10mL/L的濃度下抑制率為10.73%,100mL/L的抑制率為21.201%。3甲醛乙酯對ache活性的影響甲酸乙酯對米象成蟲的熏蒸活性結(jié)果表明,甲酸乙酯對米象表現(xiàn)出較強(qiáng)的速效性,熏蒸24h后其LC50為28.650μL/L,處理48h后LC50為25.805μL/L。乙酰膽堿酯酶(AChE)是動物體內(nèi)廣泛存在的在神經(jīng)興奮傳遞過程中起重要作用的一種酶,能通過水解突觸間隙的乙酰膽堿,而終止神經(jīng)興奮的傳導(dǎo),此酶一旦被抑制達(dá)到一定程度時,會使動物過度興奮而死亡。測定甲酸乙酯對AChE活性的影響,結(jié)果表明在15、20μL/L的濃度下甲酸乙酯對AChE具有顯著的抑制活性,且隨著藥劑濃度的增大和處理時間的延長抑制作用越明顯,酶動力學(xué)研究表明,甲酸乙酯還可以使AChE與底物ATChI的親和力下降,說明甲酸乙酯可能是通過影響了AChE的性質(zhì)從而發(fā)揮其殺蟲活性的;但是在離體條件下的影響卻不顯著,表明甲酸乙酯本身可能對AChE沒有明顯的抑制作用,而在米象體內(nèi)被代謝后的產(chǎn)物卻能明顯抑制AChE的活性。羧酸酯酶是昆蟲體內(nèi)一種主要的代謝解毒酶,該酶具有廣泛的底物專一性和重疊性,能催化水解脂肪族羧酸酯、芳酸酯及相應(yīng)的硫代酯等