第2章 細(xì)胞生物學(xué)的研究方法

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)三、掃描隧道顯微鏡光學(xué)顯微鏡技術(shù)基本參數(shù)分辨率R=0.61λ/N．A放大率1.構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。普通光學(xué)顯微鏡介紹光路圖Figure9-11aMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)腎的尿道橫切面，用蘇木精-伊紅染色Figure9-11bMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)植物根橫切面，番紅──快綠染色Figure9-14MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)幾種特殊的光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡技術(shù)把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。1.環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。2.相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本

倒置顯微鏡物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。

干涉顯微鏡

（DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。

暗視野顯微鏡聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的?？捎^察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。熒光顯微鏡特點(diǎn)：光源為短波光；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。Figure9-14MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)圖中,DNA為藍(lán)色，微管為綠色用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。Figure9-15MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)細(xì)胞有絲分裂,DNA為藍(lán)色，微管為綠色，中心體為紅色2023/10/1619熒光顯微鏡FluorescenceMicroscopy熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)Figure9-18MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)激光共聚焦掃描顯微境

用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類(lèi)似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/2023/10/1623Slide40x活細(xì)胞圖像4－維分析激光共焦顯微鏡

LSCM2023/10/1624活細(xì)胞內(nèi)分子圖像追蹤電子顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡透射電子顯微鏡以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2μm）。20世紀(jì)60年代問(wèn)世，用來(lái)觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。掃描電子顯微鏡人類(lèi)紅細(xì)胞掃描隧道顯微鏡

原理：根據(jù)隧道效應(yīng)設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。FluorescenceResonanceEnergyTransfer，F(xiàn)RET

FRET技術(shù)是檢測(cè)活體中生物大分子納米級(jí)距離和納米級(jí)距離變化的有力工具，可以檢測(cè)某一細(xì)胞中兩個(gè)蛋白是否存在直接的相互作用

FluorescenceRecoveryAfterPhotobleaching，F(xiàn)RAP

熒光漂白恢復(fù)原理:利用高能量激光束的照射使特定的區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬滅，通過(guò)非漂白區(qū)的熒光標(biāo)記分子在膜上或胞漿中運(yùn)動(dòng)至光漂白區(qū)來(lái)完成光漂白區(qū)熒光的恢復(fù)。FRAP可以用于解決活細(xì)胞內(nèi)包括蛋白定位，動(dòng)力學(xué)以及與其他成分相互作用等一系列問(wèn)題。

Freeze–EtchingFracture冷凍蝕刻Freeze–Fracture

andEtching

Replication冷凍斷裂蝕刻復(fù)型第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物二、細(xì)胞內(nèi)生物大分子的示蹤技術(shù)、原位雜交三、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài)四、流式細(xì)胞技術(shù)、技術(shù)進(jìn)展和功能離心技術(shù)差速離心密度梯度離心

——速度密度梯度離心

——等密度梯度離心SubsequentpurificationbyDensity-GradientEquilibriumCentrifugationIsolation,purification,andfractionationofproteinsSelectivePrecipitation

(ammoniumsulfate)LiquidColumnChromatography（柱層析）

Ion-exchangeChromatographyGelFiltrationChromatography又稱(chēng)排阻層析或分子篩方法：交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)

AffinityChromatographyP