牙源性角化囊腫和成釉細(xì)胞瘤體外培養(yǎng)大鼠骨吸收機(jī)制研究

牙源性角化囊腫和成釉細(xì)胞瘤體外培養(yǎng)大鼠骨吸收機(jī)制研究

角質(zhì)性角質(zhì)化（obc）和成形細(xì)胞瘤（obc）是牙科疾病的常見(jiàn)損傷。這種生長(zhǎng)具有局部入侵，通常會(huì)導(dǎo)致下頜骨的吸收和破壞。這些病損在頜骨內(nèi)生長(zhǎng)、增大,具有誘導(dǎo)局部骨吸收的能力。早期研究多集中在骨內(nèi)病變體積的增大對(duì)周?chē)墙M織的物理性壓迫作用,骨組織具有受壓力而吸收增強(qiáng)的生物學(xué)特點(diǎn)。近年來(lái)隨著對(duì)骨吸收調(diào)控和骨代謝方面研究的不斷深入,人們?cè)絹?lái)越重視病變微環(huán)境中細(xì)胞間的相互作用,腫瘤或病變細(xì)胞一般不直接引起骨組織的破壞,而是通過(guò)產(chǎn)生或誘導(dǎo)其他細(xì)胞產(chǎn)生骨吸收刺激因子間接影響破骨細(xì)胞的分化、成熟和功能活性。因此,牙源性病損局部侵襲性的強(qiáng)弱可能取決于其病變細(xì)胞活化破骨細(xì)胞及誘導(dǎo)骨吸收的能力。目前,已明確可參與骨吸收調(diào)控的相關(guān)因子很多,其中前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等可促進(jìn)骨吸收,而降鈣素(calcitonin,CT)和骨鈣素(boneGla-containingprotein,BGP)等則是促進(jìn)骨形成的相關(guān)因子。我們采用體外培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)OKC和成釉細(xì)胞瘤的體外骨吸收效應(yīng),并采用放射免疫方法定量分析牙源性病損的體外培養(yǎng)上清液中上述幾種骨吸收調(diào)控因子的含量。材料和方法1.-mem培養(yǎng)基本實(shí)驗(yàn)選用的SD大鼠(新生5天)購(gòu)自國(guó)家計(jì)劃生育委員會(huì)動(dòng)物室;α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;所用IL-6、TNF-α、PGE2、BGP和CT放射免疫測(cè)定藥盒均購(gòu)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免研究所。2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染無(wú)菌收集手術(shù)切除的25例牙源性囊腫(OKC14例、OKC伴感染6例、含牙囊腫5例)和7例成釉細(xì)胞瘤標(biāo)本,組織塊立即放入D-Hanks液中漂洗3次,再置入α-MEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清,1×10-5U/L青霉素,1×10-5U/L鏈霉素,25mmol/LHEPES)中漂洗3次,將標(biāo)本剪切為約1mm×1mm×1mm大小,置于5mlα-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h(37℃,5%CO2),收集培養(yǎng)上清液凍存于-80℃冰箱中備用。用濾紙吸干培養(yǎng)基中的組織塊、稱(chēng)重,計(jì)算并記錄各組織塊的重量和培養(yǎng)基體積的比值(g/L)。3.細(xì)胞培養(yǎng)及ca2+含量檢測(cè)乳鼠顱蓋骨器官培養(yǎng)及其上清中Ca2+測(cè)定采用經(jīng)典的體外檢測(cè)骨吸收的方法,完整取出SD大鼠顱蓋骨,于D-Hanks液中去除附著于其表面的骨膜及其他軟組織,沿冠狀縫分離左右側(cè)顱蓋骨,經(jīng)24h預(yù)培養(yǎng)(37℃,5%CO2)后,轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板(半側(cè)顱蓋骨/孔),各孔含0.4mlα-MEM培養(yǎng)基和0.1ml待測(cè)的組織塊培養(yǎng)上清(以10g/L的重量體積比值稀釋所有樣本),空白對(duì)照組僅加0.5mlα-MEM培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照組加0.5ml含10μg/LIL-1β和TNF-α的α-MEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h后,收集培養(yǎng)上清液300μl并采用原子分光光度計(jì)檢測(cè)其Ca2+含量。4.脈沖活性測(cè)定分別收集各組牙源性病損體外培養(yǎng)上清液800μl,按照試劑盒提供的操作加液程序,分別與緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)液、抗體及已知濃度的標(biāo)記抗原(125I/3H標(biāo)記)充分作用,于4℃、3500r/min離心25min,棄去上清液,在γ計(jì)數(shù)器(SN-695B型,上海)或液體閃爍計(jì)數(shù)器(LS-6500型,USA)上測(cè)定脈沖數(shù)/放射活性比值,再于標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出待測(cè)樣本濃度。5.牙源活檢塊的組織學(xué)觀察每例牙源性病損的一部分均行常規(guī)組織學(xué)染色以明確診斷。經(jīng)體外培養(yǎng)24h后的牙源性病損組織塊也行常規(guī)組織學(xué)處理,以觀察其形態(tài)變化。免疫組化染色采用鏈親和素-過(guò)氧化物酶技術(shù),分別對(duì)廣譜角蛋白(AE1/AE3)、角蛋白19(CK-19)和波形蛋白等標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。6.骨吸收相關(guān)因子含量的影響各病變組與乳鼠顱蓋骨共同培養(yǎng)的上清液中Ca2+含量,以及各組培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、PGE2、BGP和CT的放免檢測(cè)含量的組間差異,采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件的Kruskal-wallis法進(jìn)行非參數(shù)H檢驗(yàn),并對(duì)各組骨吸收相關(guān)因子含量與Ca2+含量的相關(guān)性進(jìn)行相關(guān)回歸分析。牙源病理變化對(duì)血清ca2+和tnf-的影響OKC和成釉細(xì)胞瘤標(biāo)本在體外培養(yǎng)24h后,其組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)均無(wú)明顯改變,廣譜角蛋白、角蛋白19以及波形蛋白的免疫組化染色也證實(shí)培養(yǎng)后病變組織上皮和結(jié)締組織的免疫組化表達(dá)無(wú)明顯改變(圖1~4),故將牙源性病變組織塊的體外培養(yǎng)時(shí)間定為24h。Kruskal-wallisH檢驗(yàn)表明:陽(yáng)性對(duì)照(IL-1β和TNF-α)組及各病損組的Ca2+析出濃度均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01),其中OKC伴感染組顯著高于OKC組和成釉細(xì)胞瘤組(P<0.05),其余各病損組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。各組牙源性病損培養(yǎng)上清中骨吸收因子的放射免疫測(cè)定值見(jiàn)表2。Kruskal-wallisH檢驗(yàn)結(jié)果顯示:IL-6、PGE2、TNF-α和CT含量均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),而B(niǎo)GP含量與空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);各病變組之間的比較顯示:OKC組和OKC伴感染組的IL-6含量顯著高于成釉細(xì)胞瘤組(P<0.05);OKC伴感染組CT含量顯著高于OKC組和含牙囊腫組(P<0.05);其余各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。對(duì)所有檢測(cè)樣本的Ca2+含量和各種骨吸收相關(guān)因子水平的相關(guān)回歸分析證實(shí):樣本中的IL-6水平與Ca2+析出量密切相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.552,P<0.01)。骨吸收效應(yīng)檢測(cè)OKC和成釉細(xì)胞瘤在頜骨內(nèi)可沿骨小梁間隙向周?chē)?rùn)性生長(zhǎng),引起骨組織破壞和吸收,這種生物學(xué)行為很可能與病變細(xì)胞可產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生多種骨吸收刺激因子,并在病變局部造成骨吸收亢進(jìn)有關(guān)。以往研究多涉及炎癥性牙源性囊腫,證實(shí)其在體外具有骨吸收效應(yīng)。對(duì)牙源性發(fā)育性囊腫(如OKC和含牙囊腫)及成釉細(xì)胞瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用牙源性病損組織塊體外培養(yǎng)與乳鼠顱蓋骨體外培養(yǎng)相結(jié)合的方法,比較了幾種牙源性病損的培養(yǎng)上清液引起乳鼠顱蓋骨在培養(yǎng)體系中Ca2+的釋放量,以比較不同病損在體外的骨吸收效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):各組牙源性病損均可顯著增加培養(yǎng)體系中的Ca2+釋放量,提示各組牙源性病損在體外均具有促進(jìn)骨吸收的作用,其中OKC伴感染組的體外骨吸收效應(yīng)顯著高于OKC組和成釉細(xì)胞瘤組,這可能與囊壁組織受炎癥刺激產(chǎn)生多量的細(xì)胞因子有關(guān),提示炎癥及炎癥介質(zhì)在骨吸收中可能起重要作用。Harris等、Bando等和Gervasio等分別采用波層色譜、免疫組化和ELISA等方法,證實(shí)根尖囊腫的骨吸收效應(yīng)與PGE2、IL-6和TNF-α等骨吸收因子密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用更為靈敏的放射免疫測(cè)定法定量檢測(cè)牙源性病損培養(yǎng)上清液中多種骨吸收相關(guān)因子的含量,結(jié)果表明:各組牙源性病損的培養(yǎng)上清液中IL-6、PGE2、TNF-α和CT含量均顯著高于空白對(duì)照組,其中OKC組和OKC伴感染組的IL-6水平均顯著高于成釉細(xì)胞瘤組,但與含牙囊腫組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示發(fā)育性牙源性囊腫所導(dǎo)致的骨吸收可能與IL-6水平增高有關(guān)。相關(guān)分析也證實(shí):IL-6水平與骨吸收效應(yīng)指標(biāo)Ca2+含量密切相關(guān),提示在被檢測(cè)的幾種骨吸收因子中,IL-6可能對(duì)牙源性病損所致的骨吸收發(fā)揮更主要的作用。由于本實(shí)驗(yàn)中牙源性病損的培養(yǎng)上清液與乳鼠顱蓋骨體外共孵育的時(shí)間有限(48h),這些細(xì)胞因子誘發(fā)骨吸收的機(jī)制可能與活化成熟的破骨細(xì)胞有關(guān),是否可同時(shí)影響病變微環(huán)境中破骨細(xì)胞的分化或形成尚待進(jìn)一步探討。成釉細(xì)胞瘤導(dǎo)致頜骨破壞、吸收的機(jī)制可能有別于牙源性囊腫,其臨床上的高侵襲性可能還與腫瘤的