腎上腺髓質(zhì)素激活pi3kakenosvegf信號(hào)通路參與腎腫瘤血管生成

腎上腺髓質(zhì)素激活pi3kakenosvegf信號(hào)通路參與腎腫瘤血管生成

抗高血壓藥物已經(jīng)成為治療進(jìn)展階段腎細(xì)胞癌最有效的治療策略。許多藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床，但一些患者對治療效果不滿意。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)有希望成為下一個(gè)抗血管生成治療腎細(xì)胞癌的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑槊鞔_ADM在腎細(xì)胞癌血管生成信號(hào)通路的作用以及此作用與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的關(guān)系。1材料和方法1.1細(xì)胞植物1.2抗菌劑和培養(yǎng)基ADM純品和山羊抗兔二抗購于北京博奧森公司,兔抗人eNOS抗體購于美國ABCam公司。ADMshRNA,VEGF純品,VEGF受體抑制劑,兔抗人Akt抗體,兔抗人PI3K抗體和小鼠抗人VEGF抗體購于美國santacruz公司,RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)干粉購于美國Gibcobrl公司,胎牛血清購于北京華美公司,考馬斯亮蘭蛋白定量盒由上?？婆d生物科技有限公司提供。1.3主要設(shè)備BIX-311二氧化碳培養(yǎng)箱,DG-3A電泳槽,DYY-Ⅲ7B型轉(zhuǎn)移電泳儀,UVP凝膠成相分析系統(tǒng)。1.4各組adm、vegf受體抑制劑的篩選、shr-na的計(jì)算取對數(shù)生長期,生長良好的786-0細(xì)胞分為對照組、ADM組(100μmol/L)、VEGF組(50μmol/L)、ADM+VEGF受體抑制劑組(ADM:100μmol/L,VEGF受體抑制劑:100μmol/L)、ADM+ADMshRNA組(ADM:100μmol/L,ADM+ADMshR-NA:1μmol/L)。每組設(shè)24、48、72h3個(gè)時(shí)間點(diǎn)。5組細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)基,在含5%二氧化碳的飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)后收獲細(xì)胞。1.5考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒的制備培養(yǎng)瓶內(nèi)加入裂解液,冰上裂解30min,4℃、12000r/min離心20min,吸上清至一個(gè)新的清潔EP管中,采用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒,測定上清液蛋白濃度。1.6tbt的加入每組取20μg蛋白,裂解液補(bǔ)齊容量,沸水浸泡5min。大齒梳最多可上50μl,10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS)120V電壓下分離后轉(zhuǎn)膜(PI3K:90V、60min;Akt:90V、50min;eNOS:120V、150min;VEGF:30V、30min)。5%脫脂奶粉漿膜封閉2h后加入一抗(β-actin1∶1000,Akt1∶1000,PI3K1∶1000,eNOS1∶1000,VEGF1∶400),室溫孵育1.5h,TBST充分漂洗后加入辣根酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔二抗,抗體稀釋濃度1∶7500),孵育1.5h,TBST再次充分漂洗,最后用ECL顯色試劑顯色。應(yīng)用圖像分析軟件Bandscan(Glyko公司)對顯色條帶進(jìn)行灰度分析。1.7評(píng)估結(jié)果凝膠成像系統(tǒng)(UVP,美國)LabWorks4.5軟件對蛋白表達(dá)行半定量分析,以積分吸度(IOD)值表示。1.8統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以u(píng)e0af±s表示,采用t檢驗(yàn)和方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1p>0.05Westernbolt檢測PI3K在ADM處理組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在VEGF處理組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。PI3K在ADM+ADMshRNA組3個(gè)時(shí)間組表達(dá)與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。2.2p>0.05Westernbolt檢測AKT在ADM處理組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在VEGF處理組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。AKT在ADM+ADMshRNA組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。2.3adm+vegf受體抑制劑對腎腫瘤細(xì)胞表達(dá)的影響Westernbolt檢測eNOS在ADM處理組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在VEGF處理組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。eNOS在ADM+ADMshRNA組3個(gè)時(shí)間組表達(dá)與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。2.4腎腫瘤細(xì)胞h3個(gè)時(shí)間組表達(dá)比較Westernbolt檢測VEGF在ADM處理組24、48、72h3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。VEGF在ADM+ADMshRNA組3個(gè)時(shí)間組表達(dá)與對照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。3adm對腎腫瘤的血管生成作用腎細(xì)胞癌為典型多血管腫瘤,依賴于腫瘤新生血管生成滿足其生長和進(jìn)展過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的需求量不斷增加和帶走代謝廢物,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定?？寡苌墒侵委熌I腫瘤有效策略。已經(jīng)有多種抗血管生成藥物應(yīng)用于腎細(xì)胞癌的治療,并且取得令人滿意的效果,這些藥物主要是抗VEGF藥物。ADM和VEGF一樣在人正常組織和腫瘤組織中廣泛表達(dá),已經(jīng)證實(shí)ADM作為腫瘤細(xì)胞自分泌和旁分泌因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和進(jìn)展,還促進(jìn)周圍內(nèi)皮細(xì)胞增殖和改變血管的通透性促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。ADM在腎細(xì)胞癌生成和進(jìn)展方面同樣具有促進(jìn)作用,ADM在體外低氧環(huán)境培養(yǎng)的腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高;ADM作用于腎腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)VEGFmRNA表達(dá)明顯升高,ADMRshRNA可抑制ADM這一作用;ADM和ADMR在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯高于其在正常腎組織中表達(dá),并且ADM和ADMR高表達(dá)與腫瘤組織中微血管密度成正相關(guān)性。以上研究表明產(chǎn)生和分泌ADM為腎腫瘤細(xì)胞自身保護(hù)機(jī)制,和腫瘤血管生成有關(guān)。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)大的血管生成誘導(dǎo)劑,通過激活各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促腫瘤血管生成,阻斷與VEGF有關(guān)的信號(hào)通路可達(dá)到治療腫瘤的作用。PI3K/AKT/eNOS與腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要,如PI3K/AKT在卵巢上皮癌組織中表達(dá)與腫瘤臨床分期、細(xì)胞組織學(xué)分化有顯著相關(guān)性。其在腫瘤血管生成方面的作用也得到共識(shí),活化的AKT可使eNOS磷酸化使之激活,產(chǎn)生NO,NO與血管生成密切相關(guān);PI3K/Akt還可激活激酶HDM2調(diào)控VEGF和缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞對VEGF及其他血管生成因子的表達(dá)和分泌;VEGF可反饋性活化PI3K/AKT信號(hào)通路,從而進(jìn)一步刺激血管生成;抑制PI3K/AKT/eNOS通路,可抑制VEGF的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖,遷移和增加血管通透性的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADM可激活人腎腫瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/eNOS/VEGF信號(hào)通路;VEGF可激活腎腫瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/eNOS通路。ADM作用于腎腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)VEGFmRNA表達(dá)明顯升高,表明ADM可能通過影響VEGF發(fā)揮PI3K/AKT/eNOS通路激活作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)VEGF受體抑制劑阻斷VEGF的作用后,ADM仍可激活PI3K/AKT/eNOS通路;而通過記憶靜默技術(shù),抑制ADM的作用后,PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路活性受到抑制。表明ADM還可以通過其受體直接激活PI3K/AKT/eNOS參與腎腫瘤血管