電鏡三維重構(gòu)II

內(nèi)容數(shù)學(xué)工具透射電鏡高分辨電子顯微鏡的成像原理高分辨電子顯微鏡的圖像處理電鏡三維重構(gòu)的原理電鏡三維重構(gòu)的應(yīng)用電鏡三維重構(gòu)簡介為什么用電鏡三維重構(gòu)？研究對象電鏡三維重構(gòu)主要方法常用軟件電鏡三維重構(gòu)的原理中心截面定理（富立葉空間）Randon定理（實空間）為什么用電鏡三維重構(gòu)？X-rayEM

NMR中子衍射蛋白質(zhì)晶體學(xué)結(jié)晶：mm（一般光源）；0.02mm（同步輻射光源）相位問題：同晶置換、分子置換、直接法、多波長反常散射、同晶差值傅里葉法等樣品的分子體積太大（7.5nm），衍射點可能重疊特點：分辨率高，是目前常用的方法（PDB中80%的結(jié)構(gòu)由X-ray測定）蛋白質(zhì)分辨率年方法Bacterialreactioncenter(PS)2.8?1985X-rayBacteriorhodopsin(proteinpump)3.5?1990EMBacterialporin1.8?1992X-rayProstaglandinsynthase3.5?1994X-rayPlantlight-harvestingcomplex(PS)3.4?1994EMBacterialantennacomplexLH2(PS)2.5?1995X-rayMitchondrial&Bacterialcytochromeoxidase2.8?1995X-ray[CHIP28(aquaporin)3.5?EM][Microsomalglutahiontransferase3.5?EM]ComplexI(mitochondrialatransport)25?1987EMPhotosystemIIreactioncentre(PS)17?(pr.)1993EMCalciumATPase(ionpump)14?1993EMAcetylcholinereceptor(ionchannel)9?1993EMPhotosystemIreactioncentre(PS)6?1993X-rayBand3(anionexchanger)20?1994EMBacterialantennacomplexLH1(PS)8.5?(pr.)1995EMProtonATPase10?(pr.)1995EMVirsualrhodopsin7?1995EMNa,K-ATPase15?1995EMNMR分子量受限，分子量小于100kD數(shù)據(jù)處理復(fù)雜分辨率不如X-ray特點：樣品在溶液中，不需要結(jié)晶，能夠測定動態(tài)結(jié)構(gòu)EM電子輻射導(dǎo)致樣品損傷分辨率很低數(shù)據(jù)處理復(fù)雜二維晶體的生長特點：對于單顆樣品不需結(jié)晶，能夠測定低分辨率的結(jié)構(gòu)；對于不能生長三維晶體，但可以獲得二維晶體的樣品，微米量級的晶體可用于結(jié)構(gòu)分析；分子量不受限；分析生物大分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)具有一定優(yōu)勢；也是研究細胞器和亞細胞器的重要工具。研究對象二維晶體螺旋結(jié)構(gòu)二十面體對稱性單顆非對稱單顆二維晶體LiZ.L.etal,自然科學(xué)進展,2000螺旋結(jié)構(gòu)螺旋結(jié)構(gòu)(VitoldE.G.etal,PNAS,2005)(Nogalesetal,Cell,1999)螺旋結(jié)構(gòu)(VanloockM.S.etal,J.Mol.Biol.2003)(YangS.X.etal,J.Mol.Biol.,2001)(YangS.X.etal,J.Mol.Biol.,2001)(HarutaN.etal,J.Biol.Chem.,2003)螺旋結(jié)構(gòu)(CordesF.S.etal,J.Biol.Chem.,2003)二十面體二十面體PBCV-1PolyomaHSVRotavirus對稱性單顆對稱性單顆(YangS.X.etal,J.Mol.Biol.,2001)(YangS.X.etal,J.Mol.Biol.,2002)(ChenY.J.etal,J.Mol.Biol.,2001)非對稱單顆電鏡三維重構(gòu)主要方法蛋白質(zhì)電子晶體學(xué)（二維晶體）螺旋重構(gòu)二十面體重構(gòu)單顆粒重構(gòu)ElectronTomography常用軟件二維晶體MRC-LMB2DPackageSPECTRA(NCMI)螺旋結(jié)構(gòu)MRC-LMBHelicalPackageZephyr(Brandeis)Phoelix(ResearchScripps)二十面體重構(gòu)EMANEMBLIsosahedralPackagePurdueVirusPackage單顆SPIDEREMANIMAGICTomographyIMOD單張像與三維結(jié)構(gòu)的關(guān)系單張像與三維結(jié)構(gòu)的關(guān)系投影FT截面FTρ(x,y,z)ρp(x,y)F(h,k,l)Fp(h,k)中心截面定理物體投影結(jié)構(gòu)的傅里葉變換與該物體三維傅里葉變換的一個中心截面等價如果收集足夠多物體在各個方向的二維投影像，即可獲得足夠多傅里葉空間中的中心截面，將這些中心截面按其方向組合起來，即可獲得物體三維傅里葉變換的近似值，將它作傅里葉逆變換，就得到物體的三維圖像。電鏡三維重構(gòu)的示意圖（2D）電鏡三維重構(gòu)的示意圖（3D）Randon定理（反投影back-projection)把每次測得的投影像沿與投影相反的方向作反投影，且反投影線上每點的密度都等于在該投影線上測得的投影值。對所有投影像作反投影，由此產(chǎn)生的不同反投影密度在空間上某點的加和為重構(gòu)像Randon定理（反投影back-projection)Rθ結(jié)構(gòu)象花兒一樣電鏡三維重構(gòu)的應(yīng)用電鏡三維重構(gòu)的基本步驟樣品制備單顆粒重構(gòu)入門應(yīng)用實例電鏡三維重構(gòu)的基本步驟電鏡三維重構(gòu)的基本步驟分離、純化（包括蛋白質(zhì)二維晶體的生長）電鏡樣品的制備高分辨電子顯微像的拍攝樣品的多角度照相低劑量曝光技術(shù)(Low-Dose)：聚焦和照相不在同一個樣品區(qū)域低溫電鏡技術(shù)：電鏡中樣品的溫度維持在-160℃左右像的數(shù)字化數(shù)據(jù)處理及計算機三維重構(gòu)三維結(jié)構(gòu)的解釋（構(gòu)建原子模型）樣品制備負(fù)染糖包埋單寧酸（TannicAcid）包埋冰包埋負(fù)染原理及方法：用高電子密度的染色劑沉積在蛋白質(zhì)分子周圍，使蛋白質(zhì)的電子顯微像具有較高的反差（襯度）。常用的負(fù)染劑：0.5%~5%醋酸鈾特點：襯度好；樣品容易準(zhǔn)備；分辨率低，15~20?；樣品縮小，垂直銅網(wǎng)方向樣品變扁平；樣品脫水影響蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)負(fù)染糖包埋葡萄糖與蛋白質(zhì)所處的溶液介質(zhì)有類似的物理和化學(xué)性質(zhì)，且不易揮發(fā)。用其取代蛋白質(zhì)溶液中的水介質(zhì)，可使結(jié)