第3章.細胞生物學研究方法

第三章

細胞生物學研究方法1

第一節(jié)細胞形態(tài)結(jié)構的觀察方法一、光學顯微鏡(lightmicroscopy)技術

二、電子顯微鏡(Electromicroscopy)技術

21.分辨率(resolusion)：區(qū)分兩個質(zhì)點間的最小距離。R=0.61λ/nsinα/2其中:n=標本和物鏡之間介質(zhì)折射率;λ=入射光線波長；α=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）nsinα/2稱為物鏡的數(shù)值孔徑(numericalaperature,NA)R=0.61λ/NA思考題：如何提高顯微鏡的分辨能力？樣品物鏡α342.放大倍數(shù)(magnification):最終成像的大小與原物體大小的比值。光學顯微鏡的最大放大倍數(shù)為1,000倍.電子顯微鏡的最大放大倍數(shù)為1,000,000.5一、光學顯微鏡（一）普通復式光學顯微鏡6（二）相差顯微鏡78Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.91.原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對比。2.兩個特殊構件：環(huán)狀光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：涂有光吸收物質(zhì)和相位推遲物質(zhì)。3.用途：能觀察無色、透明、活細胞中的結(jié)構。1932年P．Zernike發(fā)明，1953年,諾貝爾物理獎。101.原理：利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構的三維立體投影。

（三）微分干涉顯微鏡11122.應用：適于研究活細胞中較大的細胞器、顆粒及其運動。計算機輔助的DIC分辨率比普通光鏡提高了一個數(shù)量級。應用這一原理制備的錄像增差顯微鏡（video-enhancemicroscopy）可以觀察微管上顆粒的運動。13（四）熒光顯微鏡141.原理：以紫外線為光源照射被檢物體，使之發(fā)生熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形態(tài)及其所在的位置。2.特點：光源不直接照明，而是激發(fā)能源；需特殊的濾色鏡；分辨率高。3.用途：在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性、定位。

既可以觀察切片，也可以進行活體觀察。有免疫熒光技術和熒光素直接標記技術。15Fluorescenceimageofepithelialneuroncell

16Singapore’sNationalInstituteofEducationUKUniversityofFloridaFrenchSingaporeSouthKorea17（五）激光掃描共聚焦顯微鏡

181.原理：激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描，獲得樣品不同層面的圖像（稱為光切片），再通過計算機組合成三維重構的影像。2.優(yōu)點：分辨能力比普通光學顯微鏡提高1.4-1.7倍。3.用途：類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像，在研究亞細胞結(jié)構與組分方面廣泛應用。19laserconfocalscanningmicroscope,LCSM20LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/21（六）倒置顯微鏡221.特點:物鏡與照明系統(tǒng)顛倒。2.用途:用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光裝置。23

(七)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具,檢測某一細胞中兩個蛋白分子是否存在直接的相互作用。24490nm熒光供體（CFP）430nm激發(fā)光受體（YEP）25受體（YEP）490nm熒光供體（CFP）430nm激發(fā)光530nm黃色熒光FRET26

(八)熒光漂白恢復技術27暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡.背景黑,物體的邊緣亮,增大反差,提高分辨率.主要觀察輪廓,適于觀察活細胞內(nèi)的細胞核、線粒體液體介質(zhì)中的霉菌等。28（九）當代顯微鏡的發(fā)展趨勢采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、DIC、攝影裝置于一體。自動化與電子化。291932年德國學者MaxKnolls和ErnstRuska用波長比光短得多的電子作光源,發(fā)明了第一臺電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率，開拓了超微世界。光學顯微鏡中觀察不到而只能在電子顯微鏡下觀察的結(jié)構稱為亞顯微結(jié)構（submicroscopicstructure）或超微結(jié)構（ultrastructure）。二、電子顯微鏡301.基本構造:(1)電子槍：包括燈絲陰極和陽極。陰極電壓50~120KV，陽極0V，兩極電壓差為加速電壓。電子束波長與加速電壓的平方根成反比。(2)電磁透鏡：改變電子方向。(3)真空系統(tǒng)：保持電鏡真空。(4)照相系統(tǒng)：（一）電子顯微鏡的基本知識31顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理光鏡200nm可見光（400-700nm）玻璃透鏡不要求真空利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化電鏡0.1nm電子束（0.01-0.9nm）電磁透鏡1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差2.電鏡與光鏡的比較顯微鏡成像的基本要素有哪些?32電鏡與光鏡光路圖比較33透射電子顯微鏡(1)透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)3.電鏡的類型3435(2)掃描電子顯微鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）36

Figure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.3720世紀60年代問世，利用二次電子信號成像來觀察樣品表面形態(tài)。工作原理：電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出二級電子，由探測器收集，信號經(jīng)放大后在熒光屏上顯示出與電子束同步的掃描圖像。分辨率為6~10nm，有效放大倍數(shù)為0.2mm/10nm=20000X。38(3)掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelmicroscope,STM)Binning和Rohrer1981年發(fā)明，1986年獲諾貝爾物理獎根據(jù)量子力學的隧道效應原理制成，分辨本領高，可在真空、大氣、液體等多種條件下工作，非破壞性測量。是納米生物學研究領域中的重要工具,可在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構。

39掃描隧道電鏡下的DNA雙螺旋401.超薄切片技術（二）電鏡制樣技術412.負染色(negativeStaining)和投影(shadowcasting)技術(1)負染色:使整個載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽,而凸出的樣品則沒有染料.(2)投影技術:又叫噴鍍技術,增強背景和待觀察樣品反差.423.冰凍蝕刻(freeze-etching)

冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構。43快速冷凍深度蝕刻技術(AYeastCell)444.電鏡三維重構技術

英國生物物理學家A.Klug提出,獲得1982年諾貝爾化學獎。

電子顯微術、電子衍射與計算機圖像處理相結(jié)合，分析難以形成三維晶體的膜蛋白、蛋白-核酸復合物等大的復合體。Three-dimensionalreconstructionfromserialsections.451、離心機:低速離心機：轉(zhuǎn)速<10,000r/min高速離心機：轉(zhuǎn)速為10,000~25,000r/min超速離心機：轉(zhuǎn)速>25,000r/min。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100,000r/min一、細胞器與生物大分子的分離第二節(jié)細胞組分的分析方法46LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation47

（1）特點：介質(zhì)密度均一；主要根據(jù)被分離物質(zhì)的體積差異；速度由低向高，逐級離心。（2）用途：初步分離大小相差懸殊的細胞和細胞器，常需進一步通過密度梯度離心再行分離純化。2、差速離心（Differentialcentrifugation）483、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation)

介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，待分離的各組分分別停留在介質(zhì)的密度不同的層面。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。類型：速度沉降密度沉降49Figure3-36.Comparisonofmethodsofvelocitysedimentationandequilibriumsedimentation.501.Feulgen反應顯示DNA2.PAS反應顯示多糖3.四氧化鋨顯示脂肪4.米倫反應顯示蛋白質(zhì)二、細胞組分的顯示511、免疫熒光(immunofluorescence)技術將免疫學方法與熒光標記技術結(jié)合起來研究特異蛋白在細胞內(nèi)的分布。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。有直接免疫熒光和間接免疫熒光。三、特異蛋白質(zhì)的定位與定性52

Figure3-8.Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.53Indirectimmunocytochemistry542、免疫電鏡（immunoelectronmicroscope）技術將樣品進行特殊標記增強反差，從而進行亞細胞結(jié)構和分子的定位。根據(jù)標記方法不同分為：免疫鐵蛋白技術、免疫酶標技術和免疫膠體金技術。55Immunogoldelectronmicroscopy.Electronmicrographsofaninsulin-secretingcellinwhichtheinsulinmoleculeshavebeenlabeledwithanti-insulinantibodiesboundtotinycolloidalgoldspheres.Mostoftheinsulinisstoredinthedensecoresofsecretoryvesicles;inaddition,somecoresarebeingdegradedinlysosom