碳酸酐酶的研究進(jìn)展

碳酸酐酶的研究進(jìn)展

碳酸酶（ca，ec4.2.1）是一種含有zn2-4的金屬酶。自1933年meldung和roughton發(fā)現(xiàn)牛的血紅素以來，它不僅在所有動物組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了鈣，還在植物和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了豐富的鈣。CA對于許多真核生物的生理過程如光合作用、呼吸作用、CO2和離子運(yùn)輸、鈣化作用和酸堿平衡等是必需的。雖然CA存在于真資助所以LTRPC2和LTRPC7是具有激酶活性和離子通道活性的生命功能的蛋白質(zhì)。參考文獻(xiàn)PutneyJWetal.Bioessays,1999,21:38—41HarteneckCetal.TrendsNeurosci,2000,23:159—核生物界所有高度進(jìn)化的生物體中,但以前對來自古細(xì)菌界和細(xì)菌界原核生物的CA關(guān)注較少,自從1963年在NeisseriaSicca中首次確定存在CA以來,該酶僅從5種原核生物中純化獲得。最近的研究表明CA廣泛存在于古細(xì)菌界和細(xì)菌界代謝多樣化的原核生物種類中,這表明該酶在原核生物中的作用比先前所認(rèn)識的更廣泛和更基本。近年來對原核生物CA的研究引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。1.類ca的晶體結(jié)構(gòu)及基因序列氨基酸序列比較和晶體結(jié)構(gòu)分析表明CA可被分為三種不同的類別,分別被指定為α類、β類和γ類,它們之間沒有顯著的序列一致性,而且都是獨(dú)立進(jìn)化的。因此,CA類別是催化功能趨同進(jìn)化的極好例子。α類CA是從5～6億年前一個共同的原始基因進(jìn)化而來的,是了解較多的一類162BloomquistBTetal.Cell,1988,54:723—728MontellCetal.Neuron,1989,2:1313—1317SanoYetal.Science,2001,293:1327—1330PerraudALetal.Nature,2001,441:595—599RunnelsLWetal.Science,2001,291:1043—1047NadlerMJetal.Nature,2001,411:590—595CA,分子量為29kD的單體,存在于所有哺乳動物、一些單細(xì)胞藻類以及很少的細(xì)菌界原核生物中。γ類CA是1994年在古細(xì)菌Methanosarcinathermophila中發(fā)現(xiàn)的,簡稱為“Cam”,分子量為69kD,是一個具有左手平行的β-螺旋折疊的同型三聚體,該類CA被認(rèn)為是在30億年至45億年前進(jìn)化來的。對β類CA的了解要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對α類CA的了解,直到2000年才報道了β類CA的第一個晶體結(jié)構(gòu)。β類CA廣泛分布于高等植物、多種藻類以及細(xì)菌界和古細(xì)菌界原核生物中,可能與α類CA的進(jìn)化年代差不多。β類CA與其它兩類CA具有顯著的差異。首先,分子量比其它兩類CA大得多,一般為100～200kDa,由23～25kDa亞基構(gòu)成四聚體或八聚體。其次,從晶體結(jié)構(gòu)可見三類CA在二級結(jié)構(gòu)上的明顯差異(圖1)。第三,β類CA的晶體結(jié)構(gòu)顯示Zn2+與2個保守的半胱氨酸和1個保守的組氨酸連接在一起。系統(tǒng)發(fā)生分析表明β類比其它兩類更多樣化。序列對比顯示僅有5個殘基——3個Zn2+配基、1個天冬氨酸殘基和1個精氨酸殘基是完全保守的。近來獲得的一些CA的晶體結(jié)構(gòu)支持了這種多樣性,例如來源于紅藻(Porphyridiumpurprueum,圖1B)、豌豆(Pisumsativum,圖1C)的CA以及來源于古細(xì)菌界(M.thermoautotrophicum,圖1D)和細(xì)菌界(Escherichiacoli,圖1E)的原核生物的CA。令人驚奇的是,在P.purprueum和E.coli酶中的第4個Zn2+配基都是β類保守的天冬氨酸。P.sativum酶的Gln-51、Phe-179、Tyr-205殘基在A-F進(jìn)化枝中所有的真核CA和細(xì)菌CA中都是保守的,但在和M.thermoautotrophicum酶Cab同樣的進(jìn)化枝(進(jìn)化枝G)中所有其它CA的序列中都沒有這些殘基。這個發(fā)現(xiàn)使得Kimber和Pai提出β類是由2個亞類組成的,即“植物型”(以P.sativum酶為代表)和“Cab型”(以M.thermoautotrophicum酶為代表)。這兩個亞類在結(jié)構(gòu)上的差異和對抑制劑的不同反應(yīng)顯示它們具有不同的機(jī)制。2.ca的結(jié)構(gòu)類型CA主要催化CO2和之間的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)()。α、β和γ三類CA盡管存在總的結(jié)構(gòu)差異,但它們的活性中心都含有一個催化所必需的Zn2+。動力學(xué)研究表明所有三類CA都遵循了一個相同的兩步機(jī)制。第一步是Zn2+結(jié)合的氫氧根離子對CO2的親核攻擊(方程1),第二步是通過Zn2+結(jié)合的水分子的離子化和活性部位去質(zhì)子而使活性部位再生(方程2)。在這個步驟中,Zn2+離子作為路易斯酸使水分子的pKa值從14下降到7.0。A:α類,人同工酶Ⅱ(4CA2),30.0kD;B:β類,P.purpureum(1DDZ),62.1kD;C:β類,P.sativum(1G5C),193.6kD;D:β類,M.thermoautotrophicum(1EKJ),75.6kD;E:β類,E.coli(1160),98.8kD;F:γ類,M.thermophila(1THJ),69kD大多數(shù)CA的kcat值大于104s-1,需要一個中間物——質(zhì)子穿梭殘基(protronshuttleresidue,PSR)將質(zhì)子從Zn2+結(jié)合的水分子轉(zhuǎn)移到外部緩沖液(B)中(方程3、4)。不同類別的CA對抑制劑的敏感程度不同。在細(xì)菌界,N.sicca的CA屬α類,芳基和雜環(huán)基磺酰胺對其有強(qiáng)烈抑制作用;由E.coli的cynT基因編碼的CA屬β類,氰酸鹽和乙酰唑磺胺對其活性半抑制濃度分別為0.1和0.005mM。在古細(xì)菌界,由M.thermoautotrophicum的開放閱讀框架(ORF)編碼的CA(簡稱Cab)屬β類,是迄今發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定性最好的CA,在75℃保持15min活性仍不改變。Cab對乙酰唑磺胺和乙氧唑磺胺敏感,碘化物、硝酸鹽和疊氮化物也是Cab有效的抑制劑,但是能抑制植物β類CA的陰離子如Cl-、等對Cab活性無影響。而Cam對磺胺類抑制劑和陰離子敏感。α類原核生物CA和哺乳動物CA一樣具有一定的酯酶活性,如N.sicca的CA在催化以4-硝基苯基乙酸鹽為底物的反應(yīng)中,其酯酶活性為人CAⅡ活性的10%。β類和γ類原核生物CA和植物β類CA類似,尚未檢測到酯酶活性。3.ca在原核生物類和類上的表達(dá)采用現(xiàn)在已獲得的來自每一種α、β、γ類原核生物CA產(chǎn)生的抗血清,Smith等確定了原核生物內(nèi)代表每一CA種類的范圍。此外,基因組測序的出現(xiàn)允許從已完成的和尚未完成的原核生物的基因組序列中搜索編碼假定CA的開放閱讀框架。采用從AnabaenaecaA基因(α類)、M.thermoautotrophicumcab基因(β類)和M.thermophilacam基因(γ類)推導(dǎo)出來的氨基酸序列作為查詢蛋白質(zhì)而進(jìn)行的BLASTp和tBLASTn搜索,識別了6個假定的α類、26個假定的β類和25個假定的γ類CA序列。目前分別在淡水、海洋、嗜溫的、嗜熱的、好氧的、厭氧的、致病的、共生的、嗜甲醇的、嗜乙酸鹽的、產(chǎn)甲烷的、產(chǎn)乙酸鹽的、自養(yǎng)的、異養(yǎng)的以及光合物種中獲得了CA存在的證據(jù)。這些結(jié)果證明了與先前所認(rèn)識的相比,CA不僅在原核生物中存在的范圍更普遍,分布的物種的代謝多樣性更豐富,而且β類和γ類在原核生物CA中占主導(dǎo)地位。事實(shí)上,α類CA僅在細(xì)菌界的少數(shù)微生物中檢測到,在古細(xì)菌界卻沒有檢測到。4.ca實(shí)現(xiàn)為2作誘導(dǎo)材料對已知的CA已提出了兩條普遍的作用:(1)CO2或輸送;(2)為酶反應(yīng)提供CO2或。對光合微生物中CA的生理作用已作了大量的研究,一般認(rèn)為CA在CO2濃縮機(jī)制中起著主要作用,在藍(lán)細(xì)菌的原生質(zhì)膜和羧化小體中都發(fā)現(xiàn)有CA活性。但是,CA在古細(xì)菌界和細(xì)菌界原核生物代謝中所出現(xiàn)的范圍以及許多個體物種中包含一個以上類別CA的現(xiàn)象表明,CA在原核生物中的作用比先前所認(rèn)識的要更廣泛和多樣化。這些結(jié)果暗示了CA在原核生物生理學(xué)上的新作用。下面將討論CA在非光合原核生物中一些可能的作用。氰酸鹽對E.coli有毒,但氰酸酶可催化氰酸鹽分解成和CO2,使得氰酸鹽也可用作唯一生長氮源,來自E.coli的氰酸鹽誘導(dǎo)型CA(CynT)可將氰酸酶產(chǎn)生的CO2轉(zhuǎn)換成,防止耗竭,為氰酸鹽的進(jìn)一步分解或其它代謝過程提供所需的。而且,cynTSX和cynT缺陷型突變株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CA可提供一些保護(hù)來抵抗氰酸鹽產(chǎn)生的生長抑制。許多產(chǎn)乙酸菌在缺乏外源CO2的異養(yǎng)或自養(yǎng)條件下不能生長產(chǎn)乙酸,CA的作用可能是增加胞內(nèi)CO2水平,類似于在藍(lán)細(xì)菌中的作用,這種CO2濃縮機(jī)制可能對CO2用作唯一碳源和末端電子受體的情況更為重要。產(chǎn)乙酸菌CA的其它作用還包括調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH以及與乙酸鹽/轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相偶聯(lián)。CA在非光合原核生物的CO2固定中亦發(fā)揮了重要作用。例如草酰乙酸的合成在甲烷古細(xì)菌M.thermoautotrophicum的CO2固定途徑中是一個重要反應(yīng),M.thermoautotrophicum含有兩種酶來完成草酰乙酸的合成,即丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶,是這兩種酶的底物,而CA提供給這兩種酶,以保證這兩種酶附近有足夠的積累。CA除了為酶反應(yīng)提供CO2/外,還可以通過移去CO2/來推動反應(yīng)產(chǎn)生能量,這對于與能量產(chǎn)生相偶聯(lián)的脫羧反應(yīng)而言可能特別重要,可以認(rèn)為CA通過將CO2轉(zhuǎn)換成移去脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的CO2,從而推動脫羧反應(yīng)的進(jìn)行。在原核生物代謝中CO2無所不在,這暗示著原核生物可能利用CO2作為工具,通過CA催化不帶電的CO2與帶電的的相互轉(zhuǎn)化來行使各種生理功能,如溶質(zhì)運(yùn)輸。數(shù)據(jù)庫檢索確認(rèn)了三個可能編碼雙功能蛋白質(zhì)的序列(S.coelicolorSC2,M.bovisMB3和M.tuberculosisMT3),這些序列編碼可能的跨膜蛋白質(zhì),其N-末端部分與低親和力的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相類似,而C-末端區(qū)域與β類CA相類似。因此,CA可能利用同向轉(zhuǎn)運(yùn)或反向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制在化合物的輸送中起作用。除了催化CO2和的相互轉(zhuǎn)化外,CA還可催化一些其它的反應(yīng),如乙醛的水化、羧酸酯和各種鹵素衍生物的水解。據(jù)報道,酚酯、磺酸酯和磷酸脂可用作CA的底物。但是CA的這些功能只在研究α類人同功酶時得到確認(rèn),β、γ類CA是否也能催化這些反應(yīng)尚不可知。最近有報道認(rèn)為CA對碳酸鹽巖的溶解具有催化作用,分別在石灰?guī)r和白云巖的溶解實(shí)驗(yàn)中加入CA,結(jié)果發(fā)現(xiàn),對于石灰?guī)r,其溶解速率在高CO