PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 完整版

1PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，杜邦公司Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）?；驹硎窃谠嚬苤心M細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制。最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測(cè)人類學(xué)研究……基因組DNA獲取特定DNA片段擴(kuò)增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測(cè)序技術(shù)引物DNA聚合酶引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃變性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃PCR的改進(jìn)與完善Mullis最初使用DNA聚合酶I的Klenow片段不耐高溫37°C下反應(yīng)PCR技術(shù)的改進(jìn)與完善1988年Saiki等從溫泉中分離的一株嗜熱桿菌（thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶TaqDNA聚合酶耐熱性忠實(shí)性擴(kuò)增長(zhǎng)度平臺(tái)期Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCR的擴(kuò)增效率：循環(huán)數(shù). 擴(kuò)增子數(shù)(靶序列拷貝數(shù))1 22 43 84 165 326 6420 1,048,576301,073,741,824(10億)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用提綱

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義常規(guī)PCR技術(shù)：

對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析。無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：

利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理--------擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號(hào)閾值（threshold）：

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99

真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。C(t)value實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴(kuò)增效率實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:lgM=lgX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。確定未知樣品的C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理絕對(duì)定量25提綱

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreenⅠ特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記QQR實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1

－－－SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreenⅠ只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無(wú)熒光復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreenⅠ發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)（一般設(shè)置在復(fù)性階段）。SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強(qiáng)度TmTm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGreenⅠ法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，有雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物CyclenumberFlourescenc104102SampleCyclenumberLgofDNAconcentrationSYBRGreenⅠ法定量原理

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少。

Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。SYBRGreenⅠ法--------PCR反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreenⅠ使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè)Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同SYBRGreenⅠ法應(yīng)用范圍

起始模板的測(cè)定基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對(duì)primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。SYBRGreenⅠ法優(yōu)缺點(diǎn)

對(duì)DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

-----不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點(diǎn)

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對(duì)引物特異性要求較高缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法2-------TaqMan法與目標(biāo)序列互補(bǔ)TaqMan---水解型雜交探針

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光，R與Q分開，發(fā)熒光（熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，F(xiàn)RET）

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan法工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光TaqMan法PCR反應(yīng)的建立1、引物、探針的設(shè)計(jì)：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

72℃，45S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值引物濃度：50-900nM

探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量目的：利用核酸檢測(cè)，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)方法：從血液中提取病毒DNA，擴(kuò)增病毒基因，以TaqMan探針進(jìn)行檢測(cè)設(shè)置對(duì)照：濃度為106、105

、104

、103

的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰性和空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBVDNA

設(shè)計(jì)特異引物設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針擴(kuò)增程序結(jié)果：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)利用TaqMan法檢測(cè)血液中的HBV數(shù)據(jù)分析分析結(jié)果：HBVDNA的精確copy數(shù)為

3.7X105利用TaqMan法檢測(cè)血液中的HBVsamplesampleTaqMan法應(yīng)用范圍

起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定單核苷酸多態(tài)性分析

(singlenucleotidepolymorphism，SNP)TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

對(duì)目標(biāo)序列的高特異性

------陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單

------與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu)點(diǎn)

只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法3--Molecularbeacon法(分子信標(biāo))標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針Molecularbeacon(分子信標(biāo))工作原理

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針與DNA雜交時(shí)產(chǎn)生熒光

-----延伸過程：不產(chǎn)生熒光

------退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測(cè)熒光信號(hào)Molecularbeacon(分子信標(biāo))應(yīng)用范圍

起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP分析Molecularbeacon(分子信標(biāo))優(yōu)缺點(diǎn)高特異性：對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點(diǎn)

只能用于一個(gè)特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格比較高缺點(diǎn)幾種方法總結(jié)化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號(hào)檢測(cè)主要應(yīng)用范圍SYBRGreenI結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否復(fù)性/延伸熔解曲線分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因MolecularBeacon發(fā)夾型雜交探針有復(fù)性SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因TaqMan水解型雜交探針（5‘-3’外切）有任何步驟SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對(duì)含量差異表達(dá)分析芯片評(píng)估轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)基因型檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法unknown104103標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)敏感性高檢測(cè)低拷貝數(shù)樣品：?jiǎn)慰截悈^(qū)分小差異樣品：24，48，96，……大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測(cè)100—1010省時(shí)有效實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量相對(duì)定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）相對(duì)定量的問題解決樣品材料不均一造成的差別解決加樣過程中的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小對(duì)目的基因進(jìn)行均一化：目的基因拷貝／每一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因拷貝實(shí)時(shí)熒光定量PCR法標(biāo)準(zhǔn)樣品相對(duì)定量中的內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR法定量方法

絕對(duì)定量檢測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達(dá)差異（不同時(shí)相）

2-△C（t）雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法TaqMan法舉例標(biāo)記探針使用TaqMan探針進(jìn)行雙通道熒光定量Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針VIC標(biāo)記看家基因探針TaqMan法舉例材料準(zhǔn)備從正常乳腺組織中提取的總RNA從乳腺癌組織中提取的

總RNA含ERBB2andGAPDH的質(zhì)粒用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線

ControlsnoRNA：陰性對(duì)照RNA+noreversetranscriptase：基因組對(duì)照TaqMan法舉例反應(yīng)程序RT-qPCR反應(yīng)程序：50oC,30min95oC,15min94oC,15sec60oC,1minplateread10oC,foreverEnd35moretimesTaqMan法舉例癌癥標(biāo)記物表達(dá)Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2TaqMan法舉例實(shí)驗(yàn)結(jié)果定量Copiesng/μlTotalRNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB210951052213024922.16XGAPDH95500857301360001308001.45XTaqMan法舉例實(shí)驗(yàn)結(jié)果定量分析ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopiesng/μlTotalRNATaqMan法舉例實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

通過RT-qPCR成功檢測(cè)了ERBB2基因在不同組織的表達(dá)差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達(dá)量是正常水平的1.8倍。QX200微滴式數(shù)字PCR介紹

*WhydoDropletDigital?1stGeneration2ndGeneration3rdGenerationGelElectrophoresisReal-TimePCRDropletDigitalPCR(qualitative)(indirectquantification)(absolutequantification)

Endpoint(0’sor1’s)

LesssensitivetoPCRefficiency

Nostandardcurve

Moretoler