分析化學(xué)試驗(yàn)報(bào)告9 血紅蛋白脫輔基和重組

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一、試驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.通過試驗(yàn)，了解結(jié)合蛋白的變性與變性條件下的行為，從而對(duì)結(jié)合蛋白中輔基的作用有更深的認(rèn)識(shí)。

2.學(xué)習(xí)一種生物無機(jī)生化科研中常用的為金屬酶和蛋白質(zhì)脫輔基和重組的方法。3.把握柱層析法。二、試驗(yàn)原理

血紅蛋白是由二價(jià)鐵Fe(Ⅱ)血紅素作為輔基與多肽鏈結(jié)合組成的一種結(jié)合蛋白，它是由四個(gè)亞基組成的四聚體，分子量大約為65000Da。四個(gè)亞基中的兩個(gè)亞基的氨基酸序列一致，稱為α–亞基，每條鏈含141個(gè)氨基酸。另外兩個(gè)氨基酸序列一致的亞基，稱為β–亞基，各含146個(gè)氨基酸。α與β亞基有各自的二級(jí)、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，亞基間以非共價(jià)鍵結(jié)合在一起。

每個(gè)亞基中均含有一個(gè)血紅素輔基，它處于一個(gè)疏水環(huán)境，此疏水環(huán)境對(duì)血紅蛋白的可逆載氧功能起著十分重要的作用。Fe(Ⅱ)在血紅蛋白中始終是以+2價(jià)還原態(tài)存在的，若被氧化成Fe(Ⅲ)，則稱為高鐵血紅蛋白（MHb），其失去可逆載氧的功能。血紅素與血紅蛋白均以非共價(jià)鍵相連，其中包括:①Fe(Ⅱ)與近端組氨酸(F8His)上的Nε上的配位鍵；②卟啉環(huán)側(cè)鏈丙酸陰離子與蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈之間的鹽橋；③卟啉環(huán)中乙烯基與蛋白質(zhì)的疏水相的相互作用。

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在酸性條件下，由于蛋白的變性而使這些作用變得很弱，以至于高鐵血紅素可以從血紅蛋白的疏水區(qū)中游離出來。利用高鐵血紅素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性質(zhì)，用屢屢丁酮萃取的方法將血紅素與蛋白分開。分開得到的脫輔基血紅蛋白(ApoHb)可以再用金屬卟啉化合物(例如高鐵血紅素、鈷卟啉、銅卟啉等)進(jìn)行重組，生成各種不同金屬卟啉的血紅蛋白。

由于高鐵血紅蛋白（MHb）的紫外可見吸收光譜中，在405nm處有很強(qiáng)的特征吸收峰，而脫輔基血紅蛋白(ApoHb)只在280nm處有蛋白的特征吸收峰，當(dāng)將高鐵血紅素參與ApoHb溶液中后，重組成功的高鐵血紅蛋白（MHb）又會(huì)在405nm處出現(xiàn)它的特征吸收峰，因而血紅蛋白的脫輔基與重組試驗(yàn)均可用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

三、試驗(yàn)器材及試劑。四、操作方法

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1.氧合血紅蛋白的制備(略)

①氧合血紅蛋白溶液的制備(略)：取未溶兔血按試驗(yàn)書中的操作步驟提取得到了氧合血紅蛋白溶液。②氧合血紅蛋白溶液濃度的測(cè)定(略)：

具體為：取5?lHb，加3.0mlH2O(稀釋601倍)，用分光光度計(jì)作250nm～700nm的掃描，測(cè)得Hb的三個(gè)特征峰吸光值分別為：A415nm=1.165548，A541nm=0.131348，A576nm=0.137625，已知這三個(gè)特征峰的吸光系數(shù)值為：·ε

（mmol·cm）、ε576=14.6

415=125

l/（mmol·cm）、ε541=13.5l/

l/（mmol·cm）。

由公式：濃度C=(A×稀釋倍數(shù))/?，即可分別計(jì)算出三個(gè)濃度,取其平均值即為制備的氧合血紅蛋白Hb的濃度CHb=5.705（mmol/L）。2.氧合血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白①HbM的制備：

根據(jù)上述氧合血紅蛋白的濃度(5.705mmol/L)的用下式計(jì)算需參與過量1.3倍的K3Fe(CN)6的量(10mg/ml)(Mw=329.26)：

V(mL)＝CHb?1?329.265.705?1?329.26?1.3??1.3?0.244(mL)3310?1010?10取上述濃度(5.705mmol/L)的氧合血紅蛋白1ml(VHb)，置于10ml試管內(nèi)（內(nèi)置小攪拌子）放入冰浴燒杯內(nèi)，用微量進(jìn)樣器（針筒）吸取K3Fe(CN)6244μl，在緩慢攪拌下滴入鮮紅色的HbO2溶液內(nèi)，直到顏色變成棕黑色（MHb）的血紅蛋白。

②凝膠層析柱脫去多余的K3Fe(CN)6?？上妊b柱子

本試驗(yàn)選用交聯(lián)度高的小號(hào)膠：SephadexG-2，適于脫鹽。通過層析

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柱脫去多余的K3Fe(CN)6。將葡聚糖凝膠(Sephadex)裝柱后，取50ml10mmol/LPBS平衡，調(diào)整流量:v=1ml/min,平衡20min。將制成的MHb溶液全部上柱.。用4℃H2O洗脫（冰箱），收集棕黑色MHb，記錄總體積V1（只收集最濃的4.8ml）移入小塑料離心管內(nèi)，-20℃保存。

③MHb特征吸收峰的掃描

取收集的MHb液0.1ml稀釋至10ml(稀釋100倍)作250～700nm的掃描，得MHb的紫外可見吸收光譜圖，檢測(cè)峰值A(chǔ)405。并用Excel輸出全部數(shù)據(jù)。(第一次試驗(yàn)畢)。

三．脫輔基

以下步驟均在冰浴或4℃下進(jìn)行：

a)取3.5ml(從V1中)高鐵血紅蛋白用1mol/LHCl粗調(diào)，再用0.1mol/LHCl細(xì)調(diào)溶液pH3.0～3.5(這一步是關(guān)鍵，pH太高，脫輔基不完全，pH過低蛋白會(huì)變性)，將溶液置于有蓋的刻度離心管內(nèi)。b)參與等體積予冷丁酮，手搖振蕩萃取，靜止分層，棄上層丁酮，取下層溶液，如此反復(fù)萃取3-4次，直至上層丁酮無色為止。c)取下層淺綠色ApoHb溶液裝入透析袋，4℃對(duì)300mL5mmol/LNaHCO3分兩次透析各15分鐘，以除HCl。再對(duì)300mL蒸餾水(4℃)透析兩次各15分鐘，以除丁酮。再對(duì)4℃200ml0.1mol/LpH7.0磷酸鹽緩沖液透析兩次各15分鐘，中間取出透析袋倒置二次（此時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量白色變性蛋白沉淀）。取出袋內(nèi)溶液，用8000rp/min離心10

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min(4℃)，取上層清液，測(cè)體積V2，馬上存于冰浴。

d)取樣稀釋10倍，作250~700nm掃描，并檢測(cè)A278nm蛋白吸收峰值(以0.1mol/LpH7.0磷酸鹽緩沖液作參比)。

計(jì)算脫輔基血紅蛋白[ApoHb，其?278nm=13.1L/（mmol·cm）]的濃度:

脫輔基的產(chǎn)率＝CApoHb?V2?100%

CHb?VHb4.重組高鐵血紅蛋白

（1）取3.0mL（或?qū)嶋H量）ApoHb進(jìn)行重組，按下式計(jì)算所需高鐵血紅素的體積(過量1.2倍)：例如：若CApoHb=0.3,則：

CV(mL)＝ApoHb?3?651.5?1.2?5?1030.3?3?651.5?1.2?0.1407(mL)35?10（2）緩慢攪拌下，用10～15min滴加所需體積的高鐵血紅素到3.0mLApoHb中，用1mol/LNaOH粗調(diào)和0.05mol/LNaOH細(xì)調(diào)溶液pH至9～10，溶液顏色變?yōu)樽丶t色。并在冰浴中再放置1h。（3）用SephadexG-25裝柱脫去過量的血紅素，柱高20cm,柱子用0.1mol/LpH7.0磷酸鹽緩沖液平衡和洗脫，上樣量取1ml,用量筒收集重組