酵母雙雜交系統(tǒng)篩選抗雌激素作用酚類物質(zhì)的生物測試法

酵母雙雜交系統(tǒng)篩選抗雌激素作用酚類物質(zhì)的生物測試法

越來越多的研究表明，一些合成化合物在生物體中之后具有內(nèi)源性干預(yù)作用，并影響野生動(dòng)物的繁殖發(fā)育。具有內(nèi)分泌干擾作用的化學(xué)物質(zhì)中,其中一些是通過和雌激素受體結(jié)合而影響生物體生殖機(jī)能和生殖器發(fā)育的。目前篩選能和雌激素受體結(jié)合的化學(xué)物質(zhì)的體外實(shí)驗(yàn)方法有受體結(jié)合活性法和將雌激素受體基因克隆到酵母和培養(yǎng)細(xì)胞的方法。受體結(jié)合活性法只表示了待測物質(zhì)和受體相結(jié)合的活性,但無法區(qū)別化學(xué)物質(zhì)通過和受體結(jié)合而誘導(dǎo)雌激素作用的促進(jìn)作用和化學(xué)物質(zhì)通過和受體結(jié)合而抑制內(nèi)源性雌激素和受體結(jié)合的所謂抗雌激素作用。而利用了克隆有雌激素受體基因的酵母和培養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的原理是:待測物質(zhì)通過和受體結(jié)合后,在細(xì)胞內(nèi)由發(fā)現(xiàn)基因傳達(dá)情報(bào),最后通過測定酶的誘導(dǎo)活性或細(xì)胞繁殖等與雌激素作用的信號(hào),能夠區(qū)分促進(jìn)和抗雌激素作用的方法。但是到目前為止,利用體外生物檢測法對(duì)內(nèi)分泌干擾物質(zhì)進(jìn)行篩選的工作中,往往著眼于雌激素促進(jìn)作用而很少有關(guān)抗雌激素作用的研究報(bào)道。本研究建立了用酵母雙雜交體系篩選物質(zhì)的抗雌激素作用的方法,并用此方法對(duì)氯化三苯基錫及4-n-壬基酚、2-sec-丁基酚、2-羥基聯(lián)苯、3-叔丁基酚、2-叔丁基酚以及4-乙基-2,6-二叔丁基酚等6種酚類物質(zhì)(結(jié)構(gòu)如表1)的抗雌激素作用進(jìn)行了測試。1材料和方法1.1氯化三苯基錫的制備實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基為去除了亮氨酸和色氨酸的SD培養(yǎng)基,測定抗雌激素作用和毒性用的雙雜交酵母基因工程菌株Y190由日本大坂大學(xué)西川淳一博士惠贈(zèng);所測定的酚類物質(zhì)及氯化三苯基錫的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購買于東京化成和林純藥公司;三苯氧胺和4-羥基三苯氧胺(Sigma);二甲基亞砜(DMSO)(ACS級(jí),AMRESCO);無氨基酸氮源和氨基酸(Sigma);顯色劑o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside(ONPG)(東京化成);溶菌酶Zymolyase(20T;生化學(xué)工業(yè),日本);BIO-RAD550酶標(biāo)儀,Nunc96孔2條可拆酶標(biāo)板;JouanMR1822冷凍離心機(jī)。1.2dmso與dmso溶劑的配制篩選抗雌激素作用的實(shí)驗(yàn)使用的是克隆有人類雌激素受體(hERα)的基因工程酵母菌株Y190。具體操作步驟同測定雌激素促進(jìn)作用的方法相同,所不同的是在加入不同濃度的樣品溶液的同時(shí)加入2.5μl的200nmol/L的溶解在DMSO中的雌二醇溶液。其抗雌激素作用以待測物質(zhì)對(duì)2nmol/L雌二醇所誘導(dǎo)的β-半乳糖甘酶活性的抑制表示,計(jì)算公式如(1)式所示:抑制率/%=(A-Ax)/A×100(1)其中A為2nmol/L的雌二醇的β-半乳糖甘酶誘導(dǎo)活性,Ax為所測樣品和2nmol/L的雌二醇共存時(shí)的β-半乳糖甘酶誘導(dǎo)活性。1.3急性毒性實(shí)驗(yàn)為了區(qū)分待測物質(zhì)對(duì)雌二醇的β-半乳糖甘酶誘導(dǎo)活性的抑制作用,是由于化學(xué)物質(zhì)自身的致死毒性引起酵母菌的死亡所造成的,還是化學(xué)物質(zhì)的抗雌激素作用引起的,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)還建立了待測物質(zhì)對(duì)酵母菌急性毒性的實(shí)驗(yàn)方法。毒性測試實(shí)驗(yàn)中用醋酸鋰法導(dǎo)入GAL4AD和鼠類p53的融合基因pVA3,GAL4AD和SV40largeT-antigen的融合基因pTD1的酵母Y190菌株(YTOX)。在酵母雙雜交系統(tǒng)中,p53和SV40largeT-antigen之間顯示出很強(qiáng)的相互作用,因此導(dǎo)入pVA3和pTD1的酵母菌,即使在沒有雌二醇的情況下,也能觀測到β-半乳糖甘酶誘導(dǎo)活性,而且其活性強(qiáng)度取決于酵母菌的濃度。具體操作步驟同前,其毒性的大小是以待測物質(zhì)對(duì)β-半乳糖甘酶誘導(dǎo)活性的抑制來表示,并按式(1)計(jì)算。2結(jié)果與討論2.1苯氧胺對(duì)-半乳糖甘酶誘導(dǎo)活性的影響抗乳癌劑三苯氧胺及其代謝產(chǎn)物4-羥基三苯氧胺是典型的抗雌激素物質(zhì)(結(jié)構(gòu)如表1)。首先采用上述的抗雌激素篩選方法嘗試了對(duì)此2種物質(zhì)的抗雌激素作用活性的測試。圖1表示了三苯氧胺及4-羥基三苯氧胺的劑量-效應(yīng)曲線。從圖中可以看出當(dāng)三苯氧胺的濃度在10-5?mol/L時(shí)開始顯示抗雌激素作用,在10-4?mol/L時(shí)的抗雌激素作用幾乎達(dá)到100%,其對(duì)β-半乳糖甘酶誘導(dǎo)活性的抑制達(dá)到一半時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度(IC50)對(duì)數(shù)值為-4.73。而4-羥基三苯氧胺的濃度在10-7?mol/L時(shí)開始顯示抗雌激素作用,在10-6?mol/L左右時(shí)的抗雌激素作用達(dá)到了100%,其IC50的對(duì)數(shù)值則為-5.98。三苯氧胺和4-羥基三苯氧胺的急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表示在圖1上。從它們的酵母毒性劑量-效應(yīng)曲線可以發(fā)現(xiàn)三苯氧胺和4-羥基三苯氧胺的半致死濃度LC50均大于其IC50。這樣用本實(shí)驗(yàn)方法也證實(shí)了三苯氧胺及其代謝產(chǎn)物4-羥基三苯氧胺的抗雌激素作用。2.2氯化三苯基錫的用量用同樣的方法對(duì)氯化三苯基錫以及6種工業(yè)用的酚類物質(zhì)的抗雌激素作用進(jìn)行了測試。圖2(a)表示了氯化三苯基錫的劑量-效應(yīng)曲線。從圖中可以看出當(dāng)氯化三苯基錫的濃度在10-8?mol/L時(shí)開始顯示抗雌激素作用,在10-7?mol/L時(shí)的抗雌激素作用幾乎達(dá)到100%。其IC50的對(duì)數(shù)值為-7.25,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于酵母的半致死濃度LC50的對(duì)數(shù)值(>-5.61),表明氯化三苯基錫在極低的濃度范圍內(nèi)即具有抗雌激素作用。實(shí)驗(yàn)和野外調(diào)查結(jié)果已經(jīng)證明氯化三苯基錫可以造成軟體動(dòng)物的雄性化,從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測其作用機(jī)理之一可能是由于氯化三苯基錫的強(qiáng)抗雌激素作用。圖2(b)表示了4-n-壬基酚的劑量-效應(yīng)曲線,其LC50和IC50的對(duì)數(shù)值分別為-4.08和-4.72,兩者的比值為4.42,表明4-n-壬基酚顯示抗雌激素作用。以往的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明支鏈的4-壬基酚顯示一定的雌激素促進(jìn)作用,壬基的分枝程度很大地影響了壬基酚的作用模式。除了4-乙基-2,6-二叔丁基酚以外,其他4種物質(zhì)也同樣顯示出抗雌激素作用,圖3表示了這幾種酚類物質(zhì)的劑量-效應(yīng)曲線,在三種丁基酚中,2-叔丁基酚顯示出相對(duì)較強(qiáng)的抗雌激素作用活性。2.3激素受體結(jié)合活性前人工作建立了用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)具有雌激素促進(jìn)作用的物質(zhì)的篩檢方法,并與雌激素受體結(jié)合活性法的結(jié)果進(jìn)行了比較,預(yù)測了幾種有雌激素受體結(jié)合活性但是沒有顯示雌激素促進(jìn)作用的物質(zhì)可能具有抗雌激素作用。表2列出了對(duì)象物質(zhì)的抗雌激素作用活性,及雌激素受體結(jié)合活性值。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4-乙基-2,6-二叔丁基酚雖然顯示出非常弱的雌激素受體結(jié)合活性,但既沒有顯示雌激素促進(jìn)作用,也沒有顯示抗雌激素作用,表明該物質(zhì)不具有內(nèi)分泌干擾作