酵母雙雜交體系的構建及其在ad-baiproine中的應用

酵母雙雜交體系的構建及其在ad-baiproine中的應用

隨著對多種重要生物的大規(guī)模序列研究的結束，科學研究領域打開了一個新的時間功能重組時代。這項任務是評估矩陣中包含的所有基因的功能。生物體系的運作與蛋白質(zhì)之間的相互作用密不可分,發(fā)現(xiàn)和驗證在生物體中相互作用的蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)是認識其生物學功能的第一步。酵母雙雜交(yeasttwohybrid)技術對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測到,是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關系的技術,作為發(fā)現(xiàn)和研究活體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的技術平臺,近年來得到了廣泛的應用。1dna序列及克隆酵母雙雜交體系(yeasttwo-hybridsystem)又稱相互作用陷阱(Interactiontrap),是由Fields和Song在1989年研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中提出并初步建立的,是一種在酵母中利用轉(zhuǎn)錄激活物的重組來鑒定蛋白質(zhì)之間相互作用的方法,該系統(tǒng)利用轉(zhuǎn)錄激活蛋白GAL4的DNA結合結構域(DNAbinding-domain,BD)和轉(zhuǎn)錄激活結構域(transcription-activatingdomain,AD),分別與誘餌蛋白及可能與誘餌蛋白相互作用的捕獲蛋白相連,并共同轉(zhuǎn)入酵母敏感株細胞,如果兩個蛋白能夠發(fā)生相互作用,就能使轉(zhuǎn)錄因子原來分開的兩部分結合起來,從而激活下游報告基因。通過DNA重組技術使BD與AD分開,即使它們在同一細胞內(nèi)表達,這兩個BD和AD結構域短肽也不會發(fā)生相互作用,因而不會啟動相應被調(diào)控基因的表達。只有當分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時,才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性,并可激活上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS)的下游啟動子,使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這一特性,將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構建在同一個表達載體上,在酵母中表達兩者的融合蛋白BD-Baitprotein,將編碼AD基因與cDNA文庫的基因構建在AD-LIBRARY表達載體上;同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母,后者基因組中既不能產(chǎn)生GAL4,也不能合成LUE、TRP、HIS、ADE,因此,酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時,功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報道基因HIS、ADE、LACZ、ME11,從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。將陽性反應的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來,從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析。在酵母雙雜交的基礎上,又發(fā)展了酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術,它們被分別用于核酸和文庫蛋白質(zhì)之間、兩種蛋白質(zhì)相互作用的結構和位點以及三種不同蛋白質(zhì)之間的互作研究。然而所有的酵母雙雜交系統(tǒng)與其衍生系統(tǒng)的操作程序類似,其基本操作程序大體包括:目標基因的克隆和誘餌蛋白載體的構建;目標蛋白cDNA文庫的構建;酵母雙雜交篩選與陽性克隆鑒定。2雙冠雜交技術在蛋白質(zhì)相互作用中的應用2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)導劑單次給藥對大鼠肝臟和肝臟組織中hsf3蛋白表達的影響Raimundas等利用酵母雙雜交的方法從人肝細胞cDNA文庫篩選出一個功能未知的FLJ20850蛋白,經(jīng)研究證明該蛋白與乙肝病毒突變株在77-93和86-93氨基酸位點缺失的兩個核蛋白有特異性的相互作用。Zhou等利用酵母雙雜交、免疫共沉淀等方法發(fā)現(xiàn)與腫瘤抑制蛋白P53相互作用的一個新蛋白CCDC106,研究表明,CCDC106能促進P35的降解和抑制其生物學功能。AmélieFradetTurcotte等同樣利用酵母雙雜交技術發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒和牛乳頭瘤病毒16型的解旋酶E1都能與相撲共軛酶Ubc9特異性結合,但這種特異性反應并非細胞核凝聚的必要條件,這與以前的研究結論截然不同?？笛憔葮嫿╬SOS-baitORF3誘餌重組載體,通過誘餌蛋白的自激活檢測以及表達驗證后,從人肝細胞cDNA文庫篩選出與HEVORF3蛋白相互作用的8種功能性蛋白質(zhì),其中包括免疫信號通路激酶p110δ、線粒體膜蛋白和補體系統(tǒng)C3等,為戊肝病毒ORF3蛋白的功能研究提供了依據(jù)。倪前偉等將誘餌質(zhì)粒pBD-DOC-1成功地轉(zhuǎn)化到酵母細胞MAV203中,研究表明,誘餌質(zhì)粒pBD-DOC-1可以用于酵母雙雜交實驗,為進一步運用酵母雙雜交技術在人類組織cDNA文庫中篩選與之相互作用的蛋白奠定了基礎。Bharti等用截短的HsfA1構建誘餌載體,并成功地從番茄cDNA文庫選出了Hsf家族的一個新成員HsfA3,實驗證明HsfA3是一個組成型表達蛋白。Schoonheim等利用酵母雙雜交、親和純化串聯(lián)質(zhì)譜方法從大麥幼苗cDNA文庫中篩選出150多個與14-3-3同工型發(fā)生相互作用的靶蛋白,其中酵母雙雜交法鑒定出132種相互作用,而親和純化串聯(lián)質(zhì)譜法只鑒定出30種相互作用,兩者之間有30%的數(shù)據(jù)是重疊的。Bartholomeeusen等用酵母雙雜交、Pull-down、AlphaScreen、免疫共沉淀等方法研究表明,1型HIV整合酶與上皮細胞源性細胞cDNA文庫篩選出的LEDGF/p75C末端存在結構和空間上的相互作用,將LEDGF/p75蛋白的I365、D366、F406氨基酸突變后,該突變蛋白與1型HIV整合酶相互作用消失。2.2抗siga因子抗物酶聯(lián)免疫(ELISA)、免疫共沉淀(CO-IP)技術都是利用抗原和抗體間免疫反應來研究抗原和抗體之間的相互作用,且均為基于體外非細胞環(huán)境中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用,而在細胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚集反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測。EricRGeertsma等以DFR作為誘餌蛋白,將編碼抗體的3個可變區(qū)的基因分別克隆在AD-LIBRARY載體上,將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉(zhuǎn)化到改造后的酵母菌株中,并檢測報道基因在克隆菌落中的表達活性,從而在活細胞水平上檢測抗原和抗體的免疫反應。在結核桿菌特異性應激反應中,抗sigma因子拮抗物對于調(diào)節(jié)sigma因子的表達起重要作用。Parida等發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌抗sigma因子拮抗物與sigma因子Rv3287c蛋白間有相互作用。synemin是一種細胞質(zhì)中間絲蛋白,人類synemin至少編碼兩個剪接突變體,包括C末端插入312個額外的氨基酸大片段α-synemin和小片段β-synemin。運用酵母雙雜交技術把小片段β-synemin整個C末端尾部結構域構建為誘餌載體,從人骨骼肌cDNA文庫中篩選得知,斑聯(lián)蛋白Lin-IslMec結構域和人β-synemin有特異性的相互作用,表明β-synemin參與了斑聯(lián)蛋白的黏附,阻礙synemin蛋白的表達即可減弱細胞的黏附,增加細胞的死亡率,所以對細胞的黏附、轉(zhuǎn)移免疫應答起著重要的作用。單志新等報道,巨噬細胞移動抑制因子(MIF)與Ⅱ型穿膜蛋白CD74胞外片段間有相互作用區(qū)域,巨噬細胞移動抑制因子(MIF)能以功能域MIF50-65非依賴性方式與完整的CD74胞外片段相互結合,進行細胞信號轉(zhuǎn)導。同時,只有完整的外源CD7473-232片段可以用來有效阻斷MIF發(fā)揮生物學功能。楊鍔等通過構建pGBKT7-CS1誘餌載體,獲得了具有完整3′端的豬骨骼肌單鏈cDNA,并合成雙鏈cDNA,篩選出4個與Calsarcin-1相互作用的蛋白,經(jīng)與人的基因比較分析,發(fā)現(xiàn)Calsarcin-1與α-1肌動蛋白和α-3輔肌動蛋白互作,與骨骼肌Z線附近結構形成有關;與肌集鈣蛋白-1和肌鈣蛋白T3互作,則可影響鈣離子的調(diào)控。2.3肽適體干擾tsg113-gag蛋白的聯(lián)合許多疾病的發(fā)生都與分子間的相互作用有很大關系。用酵母雙雜交系統(tǒng)研究這些分子間的相互作用有助于闡明許多疾病發(fā)生的機理,進而為疾病治療提供理論依據(jù)。對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白質(zhì)互作可以采取藥物干擾的方法,阻止其互作用以達到治療疾病的目的。Tavassoli等運用細菌逆向雙雜交系統(tǒng)(bacterialreversetwo-hybrid)篩選環(huán)肽庫(cyclic-peptidelibrary)的方法,找到能干擾TSG101與HIVGag蛋白結合并抑制人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)出胞的5種肽適體。肽適體與HIVTat蛋白相連而能穿過培養(yǎng)的人類細胞膜,通過消減TSG101抑制這些細胞產(chǎn)生病毒樣顆粒(viruslikeparticles,VLPs)。該實驗表明,可通過肽適體干擾TSG101-Gag的結合、減少VLP的釋放從而達到治療HIV感染的目的,并肯定了小分子治療藥物(smallmoleculetherapeutics)阻斷病毒與宿主蛋白分子相互作用在抗HIV治療上的重要意義。Waheed等同樣應用細菌逆向雙雜交系統(tǒng)篩選出一種細胞周期蛋白,可干擾Gag蛋白與TSG101的結合,有效阻斷HIV-1在宿主中的出胞過程。Attali等用酵母雙雜交、定點突變證實肺炎鏈球菌膽堿結合蛋白(CBPE)是人血纖維分解酶原的重要受體,而CBPE中的磷酸膽堿酯酶Pce區(qū)與血纖維分解酶原中的kringle區(qū)是具體作用區(qū)域。該結果對鏈球菌的藥物靶點篩選提供了科學依據(jù)?？捉◤姷壤媒湍鸽p雜交技術研究甲型H1N1流感病毒非結構蛋白NS1和人切割與多聚腺苷酸化特異因子30kDa亞基(CPSF30)的相互作用,構建了一個酵母模型用于篩選NS1和CPSF30相互作用的拮抗劑,從而為篩選抗甲型H1N1流感病毒藥物奠定了基礎。2.4通過蛋白連鎖圖進行細胞相互作用的分析眾多蛋白質(zhì)在許多重要的生命活動中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的,編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析,發(fā)現(xiàn)很多新的基因和EST序列。HuaSB等利用酵母雙雜交,將所有的已知基因和EST序列為誘餌,在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白質(zhì),從而找到基因之間的聯(lián)系,建立了基因組蛋白連鎖圖(genomeproteinlinkagemap)。MariaPajunen等構建了一個插入大量外來蛋白質(zhì)基因序列的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡,這個高精確度和高分辨率的基因蛋白連鎖圖在不了解每一個突變體的組成及其結構信息的情況下為分析任何蛋白質(zhì)之間的相互作用提供了快速、簡便的方法,同時也可以在任何標準的生物學實驗室進行。利用酵母雙雜交、串聯(lián)親和提純蛋白混合物以及蛋白質(zhì)芯片技術,加之已經(jīng)繪制出來的基因組蛋白連鎖圖,為研究細胞的功能奠定了基礎。WalhoutAJ等以線蟲的生殖發(fā)育過程為研究對象,利用已知的27個線蟲發(fā)育相關蛋白建立了一個大規(guī)模的雙雜交系統(tǒng),獲得了100多個相互作用的蛋白。由此可見,酵母雙雜交為繪制生物體的蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)狀圖譜提供了條件。3酵母雙雜交檢測系統(tǒng)的改進雙雜交系統(tǒng)自誕生以來,廣泛地應用于生命研究的各個領域,