豬人工授精新技術(shù)的研究進展

豬人工授精新技術(shù)的研究進展

1射精過程的精子特性及影響因素體內(nèi)授精部位的精卵比例是相同的，即使在祖母懷孕之前也是如此。然而,需要非常多的精子才能使母豬成功懷孕,自然交配時公豬射入母豬子宮頸管的精子數(shù)為50×109個,這么多的精子數(shù)將有助于活力較強的精子克服母豬子宮內(nèi)部的阻力,從而快速到達受精部位。與自然交配時精子射入的數(shù)量相比,人工授精時要想達到高的妊娠率就必須面對這樣一個問題,即母豬獲得高妊娠率時所需的最小輸精劑量。最近在討述如何降低豬人工授精的精子劑量時,主要介紹如何利用現(xiàn)有輸精技術(shù)減少授精的精子數(shù)。然而,卵母細胞受精所要求的最低精子數(shù)不僅取決于人工輸精技術(shù),而且還受其他因素的影響,它們包括精子的受精能力和母豬的身體狀況。自然交配時,公豬射精后將精液儲存在母豬子宮頸管內(nèi),其中的精子會通過移動迅速進入子宮內(nèi)和子宮角。公豬一次射精的精子含量高達50×109~70×109個,并帶入大量的精漿(250~400mL),以擴張母豬的子宮和子宮角。眾所周知,由于授精后有部分精液在生殖道內(nèi)會產(chǎn)生倒流,造成25%~40%或是更多的精液浪費掉。剩余的精液除了小部分能到達受精位點外,其余的均被多形核白細胞(PolyMorphonuclearLeukocyte,PMN)作為由精漿和精子引發(fā)的炎癥應(yīng)答所吞噬。中性白細胞在受精后0.5~3h進入子宮腔內(nèi),這可能是受高水平的雌性激素刺激所致。伴隨著中性白細胞進入子宮腔的還有巨噬細胞和樹突細胞,但是粒細胞和淋巴細胞似乎粘附在子宮內(nèi)膜基質(zhì)上。損失的數(shù)十億精子很顯然不是沒有原因的,并且只有那些最終能到達卵母細胞的精子才會被接受。眾所周知,公豬每次射出的精液存在著異質(zhì)性,且通常和精子的成熟度或內(nèi)部的遺傳特性有關(guān);每次射出的精液在精子形態(tài)學(xué)、鞭毛活性等等方面都有很大差異。此外,精子進入輸卵管很大程度上是一個選擇性的過程,這主要取決于每個精子固有的運動能力。由于運動能力是精子的特性,此特性也是選擇精子的最佳機制。能進入輸卵管的相對精子數(shù)上的差異隨公豬的不同而不同,甚至是來自不同公豬的含有相同精子數(shù)的精液在這方面也不同。能獲得最大受精率的最小精子數(shù)不僅取決于公豬,而且也取決于授精前所用精液的操作過程。冷凍-凍融過程、流式分選操作或分期射精都會弱化精子,影響它們在雌性生殖道中的生存能力和存活時間,因此能夠到達輸卵管的精子數(shù)要少于新鮮精液。此外,另一個縮短精子壽命的因素是精子質(zhì)膜周圍精液漿的減少,這是由于高倍稀釋所致。射精時出現(xiàn)的精漿主要影響精子的生理學(xué)特性,增強射精后精子的運動能力和膜的穩(wěn)定性。在高倍稀釋的精子中添加精漿能增強精子的受精能力,對精子細胞產(chǎn)生的這種有益作用可能與異質(zhì)二聚體PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ有關(guān),該物質(zhì)有利于高倍稀釋的精子保持活力、運動能力和線粒體的活性。天然PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ?qū)Ω弑断♂尩墓i精子功能所產(chǎn)生的有益作用主要體現(xiàn)在其獨立的PSP-Ⅱ亞單位上,并且似乎不需要其多聚糖部分。最佳受精率由受精-排卵間隔、精子受精生命期、母豬個體狀況和授精部位的綜合影響決定。母豬生殖道中儲存的精子越多,占據(jù)輸卵管的成活精子也就越多,因此只需較少的精液就能夠達到采用常規(guī)人工授精技術(shù)所獲得的相同受精率。所以,應(yīng)該根據(jù)精子在母豬生殖道內(nèi)儲存位置的狀況開發(fā)人工授精技術(shù),而目前考慮的是其它會影響受精成功的因素。深部授精的新方法旨在使精子繞過子宮或限制精子通過子宮而直接進入輸卵管,因而可以減少精子因噬菌作用而造成的損失,并可以避免精子的逆流。2工藝教學(xué)ai2.1標(biāo)準(zhǔn)1:傳統(tǒng)精子輸注法目前,人工授精已經(jīng)很大程度上取代了豬場中的自然交配,究其原因在于人工授精具有經(jīng)濟、簡單和快捷(通常由養(yǎng)豬生產(chǎn)者自己操作)的優(yōu)點,并且已經(jīng)成功應(yīng)用多年。對于養(yǎng)豬業(yè)來說,其較大的價值體現(xiàn)在全球每年注冊的大約有2500萬次人工授精上。在歐洲,每年高達85%~90%的豬授精是采用人工授精的。人工授精的目的是在輸卵管中建立一個具有適當(dāng)功能的精子儲庫,以使所有排出的卵子都能受精。該授精方法借助一根導(dǎo)管吸住子宮頸從而將精液輸入子宮頸的后部(大約為子宮頸向里15cm處)。該方法推薦利用一個大容量的導(dǎo)管輸入大量的精子(通常超過2500×106個),整個發(fā)情期輸精2~3次。此方法規(guī)定了公豬每次射精可以制成大約20~25份的輸精劑量,每頭公豬每年平均授精精液產(chǎn)量為1500份,每年大約能給700頭母豬授精。雖然當(dāng)授精的精液所含精子為2500×106個時會出現(xiàn)難以滿意的結(jié)果,但利用含2000×106個精子的常規(guī)人工授精方法,再對豬群進行科學(xué)的管理,仍能取得較高的分娩率和窩產(chǎn)仔數(shù)。此外,每份精液即使含有1000×106個精子,只要輸精時機把握恰當(dāng),并且輸精過程中精液不出現(xiàn)倒流,也能取得較好的受精率。直到目前為止,常規(guī)人工授精足以能滿足養(yǎng)豬業(yè)的需求。然而,減少可用精子和/或弱化精子細胞(即冷凍-凍融后的精子、性別分流精子、精子基因轉(zhuǎn)移、包被精子,等等)數(shù)量的新型精子技術(shù)則要求開發(fā)新的授精技術(shù),以實現(xiàn)利用較少的精子也能取得滿意的受精率。此外,減少獲得成功受精所需的精子數(shù)量,可降低高附加值精液(即性別分流)的固定生產(chǎn)成本,促進此類新精液生物技術(shù)的應(yīng)用。在過去的數(shù)十年里,基于輸精劑量輸入位點的新授精技術(shù)得到了快速的發(fā)展,并無疑受到了要求上述新精液技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)中有效應(yīng)用的推動。此新方法使精液能夠輸入子宮內(nèi)(子宮頸后或子宮內(nèi)授精)、或深部的子宮角(深部子宮內(nèi)授精)、或輸卵管內(nèi)(腹腔鏡法人工授精)內(nèi)。2.2精子的輸注此授精方法的目的是將精液輸入母豬的子宮體內(nèi)。本世紀(jì)初,自1959年Hancock最先報道此授精方法以來,多家實驗室和養(yǎng)豬場再次興起了使用子宮頸后輸精的方法,由此表明子宮內(nèi)輸精可減少每次輸精所需的精子數(shù)和所用的精液劑量。但此方法的主要障礙是母豬子宮頸管,其特征是管內(nèi)有許多頸褶。已開發(fā)的多個輸精設(shè)備可以使精液穿過經(jīng)產(chǎn)母豬的子宮頸,把精子直接輸送到子宮或子宮后角。大多數(shù)這類輸精設(shè)備與商用人工授精Spirette管配套使用,而后者起到類似子宮鎖一樣的功能,堵住子宮頸,防止精液倒流。這類輸精設(shè)備通常比普通導(dǎo)管長15~20cm,通過Spirette管內(nèi)腔插入,隨后穿過子宮頸管向內(nèi)伸入到子宮內(nèi)。雖然有關(guān)此方法的介紹有很多種,但大多數(shù)每次輸入30mL含1000×106個精子的精液。此輸精方法最主要的優(yōu)點在于可以減少因精液逆流造成的精子損失,但最近有報道稱,逆流精液將占到授精精液的三分之二。Watson報道了英國于2002年首次利用子宮頸后人工授精技術(shù)進行的大型商用性試驗。結(jié)果表明,采用子宮頸后輸精技術(shù)進行的3000×106、2000×106或1000×106個精子劑量輸精,所得到的產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)都與利用常規(guī)人工授精技術(shù)進行的3000×106或2000×106個精子劑量輸精相同,僅在借助常規(guī)人工授精技術(shù)進行的1000×106個精子劑量輸精時,母豬的產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)有所下降(P<0.001)。母豬子宮頸后輸精技術(shù)具有操作簡單、高效和安全的特點,并且每次輸入的精子數(shù)可以減少到1000×106個。當(dāng)利用500×106個精子劑量時,也可達到相同的效果。雖然本次試驗表明,在進行子宮頸后人工授精時,向子宮直接輸入1000×106個精子可以取得良好的受精率,驗證了公豬一次性射精可以配制成3份人工授精精液的說法,但是相同的方法卻未能在其他豬場取得成功。最近在匈牙利和克羅地亞對1783頭經(jīng)產(chǎn)母豬進行的一次生產(chǎn)現(xiàn)場試驗獲得了相似的試驗結(jié)果,采用常規(guī)人工授精技術(shù)或子宮頸后授精技術(shù)的母豬分娩率分別達到88.1%和87.8%,但是采用子宮頸后授精技術(shù)的母豬在輸入1000×106個精子時,產(chǎn)仔數(shù)明顯的下降(12.3頭∶10.2頭)。將子宮頸后授精技術(shù)的精子輸入量減少到500×106個時,母豬的產(chǎn)仔率[78.0%∶88.2%(常規(guī)授精技術(shù)產(chǎn)仔率,下同)]和窩產(chǎn)仔數(shù)(9.4頭∶11.6頭)均下降。因此,豬場采取正確的管理措施是非常重要的。子宮頸后人工授精技術(shù)的普及率不僅不同國家各不相同,而且即使是同一個國家的不同地區(qū)也不相同。在采用本授精方法時應(yīng)特別注意要采用正確的授精技術(shù),以將對子宮頸及子宮的損傷降至最低程度,因為半剛性的擴展型輸精管可能會損傷生殖組織。2.3宮內(nèi)深部輸精法對因子分析的影響子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)(DeepIntrauterineInsemination,DUI)是將精子輸送到較深部位的子宮角的一種方法。筆者所在實驗室于1999年首次對本方法進行了介紹,并在貝爾茨維爾舉辦的“公豬精液保存”大會上作了介紹。影響本技術(shù)在母豬中應(yīng)用的主要障礙是母豬生殖道復(fù)雜的解剖學(xué)特性,授精效果不僅會受母豬子宮頸部褶皺的影響(與子宮頸后輸精法相同),而且還會受子宮角的長度和彎曲特性影響。最初的輸精導(dǎo)管是用改良的柔韌纖維內(nèi)窺鏡制成,其長1.35m,外周直徑3.3mm,內(nèi)圈直徑1.2mm。兩年以后,筆者實驗室根據(jù)先前所用內(nèi)窺鏡管的推進力和靈活性,利用新的廉價設(shè)備制成了新的DUI輸精管。這種新的輸精管長1.80m,外周直徑4mm,內(nèi)圈直徑1.80mm,其操作特點是在插入商用人工授精Spirette管(以便形成子宮鎖)后,再在Spirette管內(nèi)插入DUI輸精管,穿過子宮頸管,再向前進入子宮和子宮角?？梢灶A(yù)測的是,DUI導(dǎo)管會造成子宮粘膜的潛在性損傷,甚至?xí)＜澳肛i今后的繁殖力。有報道指出,在當(dāng)借助柔韌纖維內(nèi)窺鏡進行子宮內(nèi)深部輸精時,可以在一些母豬的子宮內(nèi)膜壁上留下明顯的傷痕。然而,任何已經(jīng)發(fā)生的子宮內(nèi)膜損傷都不會造成母豬子宮內(nèi)部或外部的出血。進行子宮內(nèi)深部輸精時和輸精完畢之后,母豬子宮的出血率非常低(<2%),并且與常規(guī)人工授精法相近。此外,對子宮深部輸精實施前(即常規(guī)人工授精)和實施后的繁殖性能比較后沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異,由此表明子宮內(nèi)深部輸精法不會影響母豬隨后的繁殖力。因此,我們推測,輸精導(dǎo)管通過子宮頸進入子宮內(nèi)不會對子宮頸和/或子宮角產(chǎn)生明顯的傷害,并且也不會對母豬的繁殖力產(chǎn)生負面影響。然而,輸精軟導(dǎo)管可以使一側(cè)子宮角產(chǎn)生像子宮內(nèi)腔輸入大量精液后引起子宮擴張一樣的相似作用。多項試驗證實,將柔韌導(dǎo)管插進母豬一側(cè)子宮角的成功率在90%以上,每次授精大約需3~4min的時間。正如先前討論到有一次將精液輸入了一側(cè)子宮角內(nèi)。但精子能夠到達對側(cè)的輸卵管,并能使較高比例的卵母細胞受精。研究表明,精子能從授精子宮角的精液儲庫運出,并且通過腹膜遷移通道送到另一側(cè)子宮角。這種假設(shè)是基于這樣一種現(xiàn)象,即雖然借助子宮內(nèi)深部輸精法輸入低劑量的精子后能在兩側(cè)輸卵管內(nèi)發(fā)現(xiàn)胚胎,但僅在一側(cè)輸卵管內(nèi)找到了精子的蹤影。我們獲得的試驗結(jié)果充實了此假設(shè):通過腹腔鏡將母豬的兩側(cè)子宮角切斷,隨后誘導(dǎo)其發(fā)情。結(jié)果發(fā)現(xiàn),精子能夠經(jīng)腹膜(trans-peritoneal)和子宮兩種不同的途徑到達對側(cè)子宮角,并且使大部分卵母細胞受精。雖然經(jīng)腹膜途徑僅使很少部分的母豬(芻5%)懷孕,然而子宮內(nèi)途徑似乎是卵母細胞受精的主要方法(酆75%)。筆者的試驗結(jié)果表明:與常規(guī)人工授精技術(shù)相比,子宮內(nèi)深部授精技術(shù)可利用精子密度稀釋20倍或原精液至少稀釋8~20倍的稀釋精液使人工誘變發(fā)情的斷奶母豬成功懷孕,且不會影響產(chǎn)仔率和窩產(chǎn)仔數(shù)。已有多項試驗測定了非人工誘變同步發(fā)情母豬利用子宮內(nèi)深部授精技術(shù)后的繁殖性能,并對該方法能否適合商業(yè)性應(yīng)用進行了評估。第一個商業(yè)性試驗在西班牙和美國進行,試驗時通過子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)給母豬輸入150×106的稀釋精子(20倍稀釋),結(jié)果采用子宮內(nèi)深部授精技術(shù)的母豬妊娠率與對照組相比并不顯著下降,大概降低2.3%~7.0%。在西班牙進行的試驗中,試驗組母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)比對照組減少1.2頭,差異不明顯;而在美國進行的試驗中,試驗組母豬窩產(chǎn)仔數(shù)減少了2.4頭,差異顯著(P<0.05)。繁殖性能上的這一下降表明了經(jīng)濟效益上的一個潛在損失,并且在總的商業(yè)模式中要在實際生產(chǎn)中應(yīng)用子宮內(nèi)深部輸精法時必須加以考慮的。在實際生產(chǎn)中,利用子宮內(nèi)深部授精技術(shù)進行150×106的稀釋精液輸精所造成的窩產(chǎn)仔數(shù)減少,與存在單側(cè)與局部兩側(cè)授精有關(guān)。在采用子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)通過5mL擴充器輸入150×106個精子的母豬中,出現(xiàn)局部兩側(cè)和單側(cè)受精的母豬比例遠高于采用常規(guī)人工授精技術(shù)輸入3000×106個精子的對照組母豬(36%,P<0.05)。同樣,在采用子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)的母豬中,與胚胎的透明帶(ZonaePellucidae,ZP)發(fā)生反應(yīng)的精子數(shù)少于采用常規(guī)人工授精技術(shù)的對照組母豬,這說明到達精子儲庫的精子數(shù)很大程度上取決于授精的精子數(shù)。在同一天用同一次射精的精液進行授精的每頭母豬在胚胎透明帶區(qū)的副精子數(shù)上也存在很大的差異,并且即使是同一頭母豬,無論采用哪種授精技術(shù),兩個子宮角在胚胎透明帶區(qū)的副精子數(shù)上間也存在著較高的差異。先前有報道稱發(fā)現(xiàn)了類似的母豬間的差異。母豬固有的特性(即子宮肌層收縮或局部吞噬作用)可能與單側(cè)受精有關(guān)。雖然筆者根據(jù)自己實驗室的初步研究結(jié)果,正在研究既能使母豬成功懷孕又能避免出現(xiàn)單側(cè)受精的子宮內(nèi)深部授精最小輸入精子劑量。但是,當(dāng)利用子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)給自然排卵的母豬輸入含600×106個精子的20mL精液時,既沒有觀察到卵母細胞的單側(cè)受精現(xiàn)象,也沒有見到其局部兩側(cè)受精現(xiàn)象?？傊?相對于常規(guī)人工授精技術(shù)而言,采用子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)可以顯著減少每次輸精所需的精子數(shù),而與母豬是否為自然排卵或誘導(dǎo)排卵無關(guān)。子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)已使含有150×106~600×106個精子的稀釋精液或含1000×106個精子的冷凍-凍融精液獲得成功。另外,經(jīng)流式分選儀分選的精子借助子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)已可成功地產(chǎn)出仔豬。2.4臟器輸精的應(yīng)用當(dāng)用高附加值的精子(即性控精子或精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因精子)進行人工授精時,開發(fā)利用超低精子數(shù)的小劑量授精技術(shù)可以提高授精效率,據(jù)認為輸卵管內(nèi)授精能夠最大限度地減少每次輸精所需的精子數(shù)。通過剖腹技術(shù),將冷凍-凍融精子或性控精子直接輸入輸卵管,已使母豬成功妊娠。遺憾的是,剖腹技術(shù)在實際生產(chǎn)中并不實用。與剖腹技術(shù)相比,腹腔鏡檢查技術(shù)在將精子直接輸入子宮或輸卵管時所造成的創(chuàng)傷要小小得多,通過經(jīng)過技術(shù)培訓(xùn)的人員,本技術(shù)已能夠在養(yǎng)豬場得到應(yīng)用。已有報道稱,腹腔鏡檢查技術(shù)已經(jīng)被用于使用低精子劑量的綿羊商業(yè)性人工輸精中。此外,通過腹腔鏡技術(shù)進行的綿羊人工輸精是唯一不會影響受精率的子宮內(nèi)輸精的人工授精方法。就母豬而言,借助腹腔鏡檢查技術(shù)將精子輸入子宮角(接近子宮輸卵管連接處),可以在每個子宮角僅輸入10×106~20×106個精子的情況下實現(xiàn)92.3%的高受精率。但是,當(dāng)輸入的精子劑量減少到5×106時,母豬妊娠率則顯著降至81.9%,這些研究結(jié)果與先前的報道相一致。在該研究中,研究人員借助剖腹技術(shù)將僅含10×106個精子的精液通過外科法授精技術(shù)輸入母豬子宮內(nèi),結(jié)果獲得了最理想的授精效果。筆者所在的實驗室對腹腔鏡檢查技術(shù)進行了改進,以適用于母豬輸卵管內(nèi)輸精。這種改進型技術(shù)必須麻醉的情況下進行,操作時使母豬呈垂頭仰臥姿勢,且與水平線呈20°的角度。在母豬腹部接近臍窩處切一個1.5cm長的口子,向上拉起切口邊緣以對抗?fàn)恳?將一個帶有嵌入式0°腹腔鏡的12-mmOptoviw套管(EthiconEndo-surgery公司,美國俄亥俄州辛辛那提市)通過傷口插入母豬體內(nèi)。進入腹腔以后,移走Optiview探頭,并用0°腹腔鏡取代。在腹腔內(nèi)注入CO2使壓力達到14mm汞柱。將兩個輔助端口放在半腹部左右兩邊,為腹腔鏡杜瓦爾(Duval)鉗狀骨針提供入口。用杜瓦爾鉗狀骨針分別控制子宮角和夾緊輸卵管,使得輸精探針順利進入。在兩個輸卵管都輸入精液后,移去套管針并進行微創(chuàng)縫合。整個小外科手術(shù)的進行時間要求控制在15min內(nèi)。輸卵管內(nèi)輸精的確可以將大量的精子(0.3×106~0.6×106)輸入管內(nèi)。母豬卵母細胞中的多精子受精塊要少于其他動物,并且在體外時,精子∶卵母細胞比例會影響多精子受精的卵母細胞。輸卵管內(nèi)腹腔鏡法授精的使用,預(yù)期會出現(xiàn)較高比例的多精子受精卵母細胞。因此,筆者檢測了輸入精子數(shù)(0.3×106、0.5×106和1.0×106)和相對于排卵的輸精時機(排卵前、排卵中和排卵后)對受精率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)輸入的精子數(shù)為0.3×106或是0.5×106個時,多精子受精的發(fā)生率非常低。因此,利用腹腔鏡法授精技術(shù)進行極小精子劑量的輸精時,使母豬妊娠的可能性較高(圖1)。只有當(dāng)輸入的精子數(shù)為1.0×106個時,多精子受精發(fā)生率才較為明顯。輸卵管的環(huán)境可對直接輸入輸卵管的精子穿透卵母細胞進行調(diào)節(jié)。筆者最近對相對于排卵的授精時間(排卵前、排卵中和排卵后)對卵母細胞的穿透和多精子受精發(fā)生率的作用進行了評估(圖2)。雖然卵巢在輸精之前進行了超聲波檢查,但用腹腔鏡觀察卵巢的狀態(tài)是生產(chǎn)現(xiàn)場的一種極好方法(圖3)。在進行輸卵管內(nèi)輸精時,當(dāng)輸入精液時母豬已經(jīng)將卵母細胞排入輸卵管,此時發(fā)生多精子受精的概率會大幅