egcg-bsa納米粒的制備工藝與體外靶向性和活性評價

egcg-bsa納米粒的制備工藝與體外靶向性和活性評價

前列腺通常發(fā)生在中年。歐洲和美國的發(fā)病率其次是肺癌。我國前列腺前期癌的發(fā)病率達(dá)25%。表沒食子兒茶素沒食子酸(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是綠茶提取物中的主要多酚類有效成分,具有來源豐富、安全低毒和易溶于水的特點(diǎn)。近年研究表明,EGCG對前列腺癌細(xì)胞在體內(nèi)外均具有顯著的抑制效果,可能機(jī)制有誘導(dǎo)凋亡、周期阻滯、信號傳導(dǎo)、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、抗氧化作用和抑制端粒酶活性等。適量的EGCG對人體無毒副作用,且對前列腺癌具有較強(qiáng)的抑制作用,但在體內(nèi)能否高效的發(fā)揮抑瘤作用少有報(bào)道。葉酸受體(folatereceptor,FR)在正常組織中的表達(dá)高度保守,只在肺、腎、脈絡(luò)膜和胎盤中有低至中等水平表達(dá),且以β亞型為主。但在大部分惡性腫瘤中,如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、腎癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和鼻咽癌中均高度表達(dá),有時可比正常組織高出100~300倍,這為葉酸(folate,folicacid,FA)介導(dǎo)藥物靶向作用于腫瘤細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)。牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)是一種安全無毒、無任何免疫原性、生物可降解的藥物載體,對親水性藥物有較高的負(fù)載能力,是靶向藥物傳遞系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)。因此,本文以葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒作載體,制備了EGCG白蛋白納米粒(FA-EGCG-BSANP),并對其形狀、粒徑、靶向性和體外活性等方面進(jìn)行了探討。ecgg-bsnp的制備試劑與材料葉酸(folate,FA,Sigma);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,上海延長生化科技發(fā)展有限公司);二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,上海延長生化科技發(fā)展有限公司);異硫氰酸熒光素(FITC,Sigma);EGCG(Sigma,純度98%);白蛋白(BSA,Sigma);0.25%戊二醛溶液(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所);二甲基亞砜(DMSO,Sigma,純度>99.5%);四甲基偶氮噻唑鹽(MTT,Sigma);F12細(xì)胞培養(yǎng)液(F12NutrientMixture[Ham],Gibco);優(yōu)級胎牛血清(FBS,中國科學(xué)院天津?yàn)笊?;含EDTA胰蛋白酶(0.25%Trypsin&0.02%EDTA,Gibco);前列腺癌細(xì)胞(PC-3,中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。儀器PicoplusⅡ原子力顯微鏡(MI,USA);Waters高效液相色譜儀(USA);UV-2550全波長分光光度計(jì)(Shimadzu);TE2000-E激光共聚焦顯微鏡(Nikon);F-2500熒光分光光度計(jì)(Hitachi,Japan);StatFax-2100酶標(biāo)儀(Awareness,USA)。葉酸活性酯的制備稱取葉酸1g,超聲溶于DMSO(20mL,含三乙胺0.5mL),20℃時攪拌下加入DCC0.94g和NHS0.52g,避光反應(yīng)12h,抽濾去除沉淀,余液加入2倍體積的乙醚并攪拌產(chǎn)生沉淀,抽濾,并用乙醚洗滌所得沉淀,干燥即為葉酸活性酯。EGCG-BSANP制備EGCG-BSANP制備步驟為:稱取適量BSA和EGCG加蒸餾水溶解,室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤脒m量無水乙醇和0.25%戊二醛溶液,攪拌反應(yīng)適當(dāng)時間,離心,沉淀用等體積蒸餾水分散即得EGCG-BSANP混懸液。采用單因素法考察BSA質(zhì)量濃度(10、20和30mg·mL-1)、EGCG質(zhì)量濃度(2.5、5、7.5和10mg·mL-1)、無水乙醇用量(1、3、5和7倍蒸餾水量)、戊二醛用量(5、10、25、50和100μL)和反應(yīng)時間(3、6、12和24h)對EGCG-BSANP的平均粒徑、成球率、載藥量和包封率的影響,確定優(yōu)化制備工藝。FA-EGCG-BSANP制備稱取葉酸活性酯50mg,溶于DMSO1mL中。另取制備的EGCG-BSANP溶液2mL,用1mol·L-1Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液調(diào)節(jié)pH10。將二者混合攪拌反應(yīng)45min,離心,收集沉淀,最后用蒸餾水分散得FA-EGCG-BSANP混懸液。FA-EGCG-BSANP的形狀與粒徑測定取FA-EGCG-BSANP20μL均勻分布于新解離的云母片上,自然風(fēng)干,置于原子力顯微鏡下,觀察其形狀及粒徑分布。HPLC測定包封率和載藥量將制備的FA-EGCG-BSANP的混懸液冷凍干燥,取一定量的凍干粉用胰酶在37℃搖床內(nèi)消化4h,采用HPLC檢測消化液中EGCG的含量,計(jì)算EGCG載藥量和包封率。計(jì)算公式如下:EGCG標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=1×10-7x-0.0219(y:EGCG質(zhì)量濃度,mg·mL-1;x:峰面積),相關(guān)系數(shù)r2=0.9992。包封率=WbsanpEGCG/WtotalEGCG×100%,載藥量=WbsanpEGCG/WBSANP×100%(式中WtotalEGCG為總藥物量,WbsanpEGCG為FA-EGCG-BSANP凍干粉中EGCG藥物量,WBSANP為納米粒的總量)。成球率測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白含量測定法測定蛋白含量。取適量反應(yīng)結(jié)束后EGCG-BSANP的混懸液,超速冷凍離心,取上清液0.1mL,加入蒸餾水0.90mL,考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑5.0mL,充分混合,放置2min后,于595nm波長下測定吸收度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未成球蛋白質(zhì)量,通過公式計(jì)算成球率。成球率=(W總-W未成球)/W總×100%。葉酸與白蛋白偶聯(lián)比測定將FA-EGCG-BSANP用胰酶在37℃搖床內(nèi)水解4h。設(shè)置對照組,即未加胰酶水解,其他反應(yīng)條件相同。用全波長分光光度計(jì)檢測這兩個樣品內(nèi)葉酸含量。EGCG納米制劑靶向性測定利用熒光(FITC)修飾白蛋白技術(shù),對FA-EGCG-BSANP進(jìn)行標(biāo)記。即用0.025mol·L-1碳酸鹽緩沖溶液(pH8.6)將FITC配置成5mg·mL-1溶液,于4℃冰浴中與白蛋白納米粒反應(yīng)12h。分別制備3種不同樣品:(1)FA+EGCG-BSA納米粒(機(jī)械混合);(2)FA-EGCG-BSA納米粒(偶聯(lián));(3)EGCG-BSA納米粒(無葉酸),分別作用于PC-3腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)24h,置于激光共聚焦顯微鏡下在激發(fā)波長為500nm,檢測波長為530nm下檢測熒光強(qiáng)度,并將培養(yǎng)后細(xì)胞用TritonX100-PBS緩沖溶液破碎,用熒光分光光度計(jì)測定其熒光強(qiáng)度。同時,按照該方法進(jìn)行不同濃度的FA-EGCG-BSA納米粒的測定。MTT法測定EGCG抑瘤率取對數(shù)生長期細(xì)胞,接種于96孔板,每孔100μL。培養(yǎng)24h后,設(shè)平行培養(yǎng)液對照孔和調(diào)零孔,其他分別加入EGCG、FA+EGCG-BSA納米粒、FA-EGCG-BSA納米粒和EGCG-BSA納米粒10μL。加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)48h,取出后每孔加入MTT20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出96孔板,棄孔內(nèi)液體,每孔加入DMSO150μL,迅速用水平振蕩器搖動,使孔內(nèi)紫色結(jié)晶物充分溶解,用酶標(biāo)儀測定吸收度值(檢測波長492nm,參比波長630nm)。將正常細(xì)胞存活率設(shè)為100%,計(jì)算加藥細(xì)胞存活率,從而得出抑制率。數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin7.5軟件處理,以表示。顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn),P<0.05為有顯著性差異。結(jié)果1ecgg-bsnp的包封和最佳工藝條件的確定在確定EGCG-BSANP制備工藝時,采用單因素影響試驗(yàn)法考察了白蛋白濃度、EGCG濃度、無水乙醇用量、戊二醛用量和固化時間等因素對納米粒成球率、粒徑及包封率的影響。結(jié)果表明:當(dāng)BSA質(zhì)量濃度分別為10、20和30mg·mL-1時,所得EGCG-BSANP平均粒徑相應(yīng)為210、368和445nm,所以本實(shí)驗(yàn)制備EGCG-BSANP時選擇BSA質(zhì)量濃度為10mg·mL-1。當(dāng)EGCG濃度分別為2.5、5、7.5和10mg·mL-1時,載藥量分別為8.4%、15.1%、24.5%和32.5%,相應(yīng)的包封率為96.5%、92.8%、86.6%和80.3%。成球率為載體分子生成納米粒的比率,是衡量白蛋白載體使用效率的重要指標(biāo),成球率越高,納米粒的得率相應(yīng)也越高。為了研究靶向的需要,本實(shí)驗(yàn)選擇具有較高成球率且盡可能高的載藥量的樣品,故選擇EGCG的質(zhì)量濃度為10mg·mL-1。當(dāng)乙醇用量分別為溶解BSA蒸餾水量的1、3、5和7倍,EGCG-BSANP的成球率分別為80.2%、93.5%、94.1%和93.8%,即乙醇用量在達(dá)到3倍蒸餾水量后,成球率已符合要求,增加乙醇量成球率也基本恒定在93.5%左右。為考察戊二醛用量對成球率的影響,分別加入0.25%戊二醛5、10、25、50和100μL,成球率分別為74.9%、85.0%、93.8%、95.1%和94.5%,當(dāng)戊二醛用量為25~100μL,成球率較高,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選為50μL。為考察不同反應(yīng)時間對成球率的影響,反應(yīng)時間分別為3、6、12和24h,所得成球率相應(yīng)為75.4%、81.6%、97.1%和98.2%。反應(yīng)時間小于12h,成球率不太滿意,游離蛋白過多。而在反應(yīng)時間達(dá)到12h后,成球率符合要求。綜合以上單因素考察結(jié)果,確定EGCG-BSANP的制備工藝如下:稱取BSA20mg和EGCG10mg溶于蒸餾水2mL,在攪拌下逐滴加入無水乙醇6mL和0.25%戊二醛50μL,攪拌12h,離心,沉淀用等體積的蒸餾水分散沉淀得EGCG-BSANP混懸液。FA-EGCG-BSANP的原子力觀察結(jié)果如圖1所示,為近球形顆粒,分散性較好。圖2為FA-EGCG-BSANP的粒度分布,分布區(qū)間為20~250nm,平均粒徑約為200nm。3載藥量與包封率的測定分別取3批最優(yōu)條件下制備的FA-EGCG-BSANP,依照前述方法測定各批樣品的載藥量與包封率,結(jié)果包封率為(81.5±1.8)%,載藥量為(29.3±0.6)%(n=3)。4fa-ecgg-bsnp的紫外吸收光譜通過全波長分光光度掃描,得知葉酸活性酯在281nm處有最大吸收峰,在該波長下測定葉酸活性酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=14.951x-0.8468,R2=0.9988(y:葉酸活性酯質(zhì)量濃度μg·mL-1;x:吸收度)。對照組與FA-EGCG-BSANP的紫外吸收光譜如圖3所示,其中1、2和3分別為葉酸活性酯標(biāo)準(zhǔn)品、胰酶水解的FA-EGCG-BSANP樣品和未水解的FA-EGCG-BSANP樣品。由圖可見,對照組樣品中無游離葉酸存在,從而證明了水解組樣品中檢測出的葉酸是已與白蛋白相偶聯(lián)的部分,標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得葉酸偶聯(lián)為18.363μg·mL-1BSA,通過分子質(zhì)量換算可知,白蛋白摩爾數(shù)/偶聯(lián)葉酸摩爾數(shù)=1∶2.754。5fa-ecgg-bsnp的熒光修飾將EGCG質(zhì)量濃度為50μg·mL-1的FA-EGCG-BSANP、FA與EGCG-BSANP機(jī)械混合物和EGCG-BSANP,進(jìn)行FITC熒光修飾,分別與前列腺癌細(xì)胞PC-3共培養(yǎng)4h,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察PC-3細(xì)胞對納米粒的攝取情況,結(jié)果如圖4所示。PC-3細(xì)胞對FA-EGCG-BSANP的攝取量最多,明顯高于其他兩組,并且FA與EGCG-BSANP機(jī)械混合物和EGCG-BSANP被PC-3細(xì)胞的攝入量相當(dāng)。結(jié)果表明,通過葉酸受體介導(dǎo)可以顯著提高前列腺癌細(xì)胞PC-3對FA-EGCG-BSANP的攝取能力,能明顯提高EGCG對PC-3的靶向性。取上述相同量共培養(yǎng)的細(xì)胞用TritonX100-PBS緩沖溶液破碎,測定其熒光強(qiáng)度,結(jié)果如圖5所示。對照組(CK)、FA-EGCG-BSANP組(1)、FA與EGCG-BSANP機(jī)械混合物組(2)和EGCG-BSANP組(3)與PC-3細(xì)胞作用后的熒光強(qiáng)度分別為0.151、45.36、1.636和1.918,即FA-EGCG-BSANP對PC-3的作用最強(qiáng),與圖4所得結(jié)論一致。而FA與EGCG-BSANP機(jī)械混合物組略低于EGCG-BSANP(P>0.05),可能與游離FA優(yōu)先占據(jù)PC-3表面的受體有關(guān),從而降低了腫瘤細(xì)胞對納米粒的攝取能力。將EGCG質(zhì)量濃度分別為1、20和40μg·mL-1FA-EGCG-BSANP進(jìn)行FITC熒光修飾,分別與前列腺癌細(xì)胞PC-3共培養(yǎng)4h,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察PC-3細(xì)胞對納米粒的攝取情況,結(jié)果如圖6所示。隨著FA-EGCG-BSANP濃度的增加,PC-3細(xì)胞對其攝取量越多,其熒光也越強(qiáng)。這說明PC-3細(xì)胞對FA-EGCG-BSANP的攝取具有濃度依賴性的特點(diǎn)。測定上述相同量共培養(yǎng)的細(xì)胞破碎液的熒光強(qiáng)度結(jié)果如圖7所示。對照組與EGCG質(zhì)量濃度分別為1、20和40μg·mL-1的FA-EGCG-BSANP組作用后的PC-3細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別為0.151、15.512、26.55和35.136,即PC-3細(xì)胞對FA-EGCG-BSANP的攝取具有較強(qiáng)的濃度依賴性,與圖6所得結(jié)論一致。6fa-ecgg-bsonp對3細(xì)胞毒性的影響將對照(BSANP)與EGCG質(zhì)量濃度為20μg·mL-1的FA-EGCG-BSANP、EGCG、FA與EGCG-BSANP機(jī)械混合物和EGCG-BSANP與PC-3細(xì)胞共培養(yǎng)48h,采用MTT法測定致死率,結(jié)果如圖8所示。對照組(1)、FA-EGCG-BSANP組(2)、EGCG(3)、FA與EGCG-BSANP機(jī)械混合物組(4)和EGCG-BSANP(5)對PC-3細(xì)胞的致死率分別為7.8%、82.8%、58.6%、51.5%和55.1%,即FA-EGCG-BSANP對PC-3的作用最強(qiáng),FA與EGCG-BSANP機(jī)械混合物和EGCG-BSANP與EGCG的抑制率相當(dāng),并且抑制率與PC-3對這些納米粒的攝取能力呈正相關(guān)。與圖4結(jié)果一致。這說明FA提高了EGCG對PC-3腫瘤細(xì)胞的靶向性,并提高了對細(xì)胞的致死作用,從而提高了EGCG作為一種潛在抗癌藥物的治療效果。ecgg-bsnp的制備工藝葉酸受體是一種細(xì)胞表面蛋白,在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞均高度表達(dá),在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)也非常顯著。本研究嘗試?yán)萌~酸偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)作為藥物載體,包裹EGCG,成功制備了平均粒徑約200nm的FA-EGCG-BSAN