動物源性食品中裂頭蚴檢測方法編制說明

《動物源性食品中裂頭蚴檢測方法》編制說明注：提交時黑色和藍(lán)色字均不可刪減。沒有的應(yīng)寫“無”。一、工作簡況（一）任務(wù)來源本任務(wù)來源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管司《關(guān)于下達(dá)2023年農(nóng)業(yè)國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃的通知》（農(nóng)質(zhì)標(biāo)函[2023]51號），項目名稱：制定《動物源性食品中裂頭蚴檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)，項目編號：NYB-23093。該任務(wù)的制定背景如下：1、裂頭蚴嚴(yán)重危害動物性食品的質(zhì)量和安全迭宮絳蟲（Spirometraspp.）是一種常見、危害嚴(yán)重的人獸共患食源性寄生蟲，廣泛寄生于豬、犬、貓、禽鳥類、蛇、蛙、魚、野生動物及人類體內(nèi)，對宿主機(jī)體造成嚴(yán)重的損傷，甚至威脅生命。其中犬、貓為其終末宿主；豬、禽、魚類、人等動物為其中間宿主或轉(zhuǎn)續(xù)宿主，此時寄生的是其幼蟲裂頭蚴（Plerocercoidlarvae，亦稱spargana）。根據(jù)跌宮絳蟲線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基1（Mitochondrialcytochromecoxidasesubunit1,cox1）基因序列分析，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該屬寄生蟲存在6個有效種（系），分別是：歐猥跌宮絳蟲（Spirometraerinaceieuropaei），主要流行于歐洲；虛假跌宮絳蟲復(fù)合體1（Spirometradecipienscomplex1），主要流行于美洲；虛假跌宮絳蟲復(fù)合體2（Spirometradecipienscomplex2），主要流行于美洲；Spirometrafolium，主要流行于非洲；曼氏跌宮絳蟲（Spirometramansoni），主要流行亞洲，在東南歐洲（如烏克蘭）、大洋洲、非洲也有報道；亞洲跌宮絳蟲（Spirometraasiana，以前稱為Spirometrasp.1），目前主要流行于日本。其中，我國流行的主要是曼氏跌宮絳蟲。豬感染跌宮絳蟲裂頭蚴后，引起食欲不振、非外寄生蟲性皮膚發(fā)癢、生長緩慢等癥狀，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。任務(wù)承擔(dān)單位自2015年起，持續(xù)承擔(dān)國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目中畜禽產(chǎn)品病原菌和寄生蟲污染風(fēng)險評估工作，開展了上海、重慶、山東、廣東、浙江等省市豬產(chǎn)品中跌宮絳蟲裂頭蚴攜帶情況的監(jiān)測工作，發(fā)現(xiàn)2015和2016年上海、重慶、廣州等地豬肉中曼氏裂頭蚴的陽性率分別達(dá)3.57%和0.14%，其他年度也存在不同程度的污染；2015年~2018年，上海多個大中型屠宰場、區(qū)縣農(nóng)貿(mào)市場、超市采集的豬肉中裂頭蚴的陽性率為0.53%。這些結(jié)果提示，上述地區(qū)豬群中存在跌宮絳蟲裂頭蚴感染，對豬群健康及養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益存在潛在威脅。2、裂頭蚴嚴(yán)重危害消費(fèi)者的健康食源性和水源性腹瀉病每年導(dǎo)致約220萬人死亡，其中多數(shù)是兒童[世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization，WHO），/foodsafety/areas_work/foodborne-diseases/zh/]。WHO更是將2015年世界衛(wèi)生日（4月7日）的主題定為“食品安全”。我國黨和政府歷來高度重視包括豬肉在內(nèi)的動物食品安全問題。十九大報告指出，要“實施食品安全戰(zhàn)略，讓人民吃得放心”。但我國動物食品的質(zhì)量和安全離人民群眾的期望仍有較大差距，食品安全事故頻發(fā)，其中，動物源性病原是引發(fā)動物食品安全事件最主要的因素。2011~2014年，我國報告的食源性疾病爆發(fā)次數(shù)由每年809次遞增至1480次，患病人數(shù)由14057人遞增至17651人；2008~2012年，衛(wèi)生部收到食源性疾病爆發(fā)事件1244起，發(fā)病44856人，死亡749人，其中由動物源性病原引起的食源性疾病事件數(shù)占我國食源性疾病事件數(shù)的71.0%，發(fā)病人數(shù)占79.6%，死亡人數(shù)占62.0%（夏咸柱等，2016）。豬肉是我國居民最喜歡的肉類食品，2016年，我國居民人均肉類消費(fèi)量為26.1kg，其中豬肉為19.6kg，占75.1%。作為我國最主要肉類來源的豬肉，顯然在食源性疾病感染事件中扮演著及其重要的角色。食源性寄生蟲就是其中引發(fā)動物性食品安全事故的一類重要病原。2014年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Foodandagricultureorganization,FAO）和WHO根據(jù)全球患病人數(shù)、全球分布情況、發(fā)病的嚴(yán)重程度、病死率、加重疾病的潛力、寄生蟲-食物途徑與國際貿(mào)易的關(guān)系、對經(jīng)濟(jì)的影響程度和范圍等方面對食源性寄生蟲進(jìn)行評分，發(fā)現(xiàn)24種寄生蟲的危害較大，跌宮絳蟲就包含在其中（Robertsonetal,2013）。迭宮絳蟲的幼蟲裂頭蚴可寄生于人體的不同部位，其中眼裂頭蚴病最常見，可引起眼臉紅腫、結(jié)膜充血、奇癢、流淚，伴發(fā)熱、惡心和嘔吐，眼球運(yùn)動障礙，嚴(yán)重者視角膜潰瘍，并發(fā)白內(nèi)障而失明；皮下裂頭蚴病導(dǎo)致皮下結(jié)節(jié)、瘙癢、炎癥、觸痛或持續(xù)疼痛；腦裂頭蚴病常陣發(fā)頭痛，嚴(yán)重時昏迷、嘔吐、視力模糊、肢體麻木甚至癱瘓；內(nèi)臟裂頭蚴病可引起呼吸道咳血、消化道炎癥、尿道或膀胱炎癥，后果嚴(yán)重。迭宮絳蟲呈世界性分布，亞洲常見人患病的報道，全球病例超過1400例，我國1000多例，尤以南方省區(qū)多見。近年來，該病發(fā)病率呈上升趨勢，尤其腦脊髓裂頭蚴病的比例明顯增高，成為我國重要的人獸共患食源性寄生蟲病之一。1991-2001年上海盧灣區(qū)居民患寄生蟲病住院病人中，由食源性寄生蟲引發(fā)的占45.9%，其中裂頭蚴病占0.78%。陳韶紅等（2014）對2011-2013年上海臨床醫(yī)院送檢樣品進(jìn)行了寄生蟲檢測結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)在送檢的10212份血清樣品中，曼氏迭宮絳蟲占17.5%（128/730）；對5939份糞便、痰液、體液和病理切片樣品進(jìn)行病原學(xué)檢測，共檢出曼氏跌宮絳蟲6例。然而，在動物源性食品生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)鏈中，對畜禽生長危害重大的疫病在養(yǎng)殖場受到重視，危害小但嚴(yán)重危害食品安全的病原如裂頭蚴長期被忽視；少量檢疫性病原如旋毛蟲在屠宰環(huán)節(jié)得到重視，大量嚴(yán)重危害畜禽產(chǎn)品安全的病原檢測闕如；貯藏、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)基本沒有監(jiān)測，從而使動物性食品存在極大的安全隱患。然而，迄今我國尚無動物源性食品中跌宮絳蟲裂頭蚴檢測方法技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)在實施，僅有衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)《裂頭蚴病的診斷》（WS438-2013

）、《裂頭絳蟲幼蟲檢測》（WS/T571-2017）。人裂頭蚴病診斷標(biāo)準(zhǔn)不適合動物源性食品中裂頭蚴的檢測，水產(chǎn)品中寄生蟲的檢驗技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)也不適合畜禽等動物。為規(guī)范檢測、強(qiáng)化監(jiān)管和執(zhí)法，亟待建立動物性食品中裂頭蚴PCR檢測方法技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的制定將極大提升動物源性食品中裂頭蚴的檢測工作，提升動物產(chǎn)品的質(zhì)量安全水平。（二）起草單位和主要起草人及其所做的工作（三）主要工作過程要按標(biāo)準(zhǔn)各階段為單位分別編寫。列出各階段的關(guān)鍵內(nèi)容。征求意見、審查階段的主要內(nèi)容要詳細(xì)給出。征求意見要對征求對象的代表性、回復(fù)情況、意見處理情況進(jìn)行總結(jié)說明。起草階段（2014年10月-2019年6月）（1）了解和學(xué)習(xí)階段（2014年10月-2015年3月）主要了解和學(xué)習(xí)了裂頭蚴病研究進(jìn)展、國內(nèi)外動物源性食品中裂頭蚴最常使用的檢測技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)。同時，了解了國內(nèi)外人和動物裂頭蚴現(xiàn)有檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，尤其是衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《裂頭蚴病的診斷》（WS438-2013

）等。（2）技術(shù)優(yōu)化階段（2015年3月-2019年3月）自2015年3年起，對國內(nèi)外報道的動物源性食品中裂頭蚴病原學(xué)檢測、PCR檢測技術(shù)進(jìn)行了比較和優(yōu)化，在實驗室內(nèi)相繼建立了上述技術(shù)，并運(yùn)用建立的技術(shù)，對田間采集的豬肉、蛙、蛇等樣品進(jìn)行了檢測，對陽性樣品進(jìn)行了部分基因序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育研究。2016年7月起，對裂頭蚴病免疫學(xué)檢測技術(shù)進(jìn)行了研究，開展了曼氏裂頭蚴免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選獲得了20個潛在的免疫診斷抗原，開展了部分抗原基因的克隆、表達(dá)、免疫反應(yīng)性研究；克隆表達(dá)了曼氏跌宮絳蟲半胱氨酸蛋白酶（CysteineProtease,CP）編碼基因的克隆、表達(dá)、重組蛋白反應(yīng)原性研究，利用重組半胱氨酸蛋白酶（rSmCP）建立了間接ELISA診斷技術(shù)；制備了曼氏跌宮絳蟲裂頭蚴可溶性抗原和排泄分泌抗原，建立了間接ELISA診斷技術(shù)；比較了上述ELISA診斷方法的敏感性和特異性，并開展了現(xiàn)場樣品的初步應(yīng)用。通過上述研究和比較，并經(jīng)田間樣品檢測和應(yīng)用，最終確定目前申報的方法。（3）起草階段（2019年4月-2019年6月）根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)、前期研究進(jìn)展，參考有關(guān)技術(shù)規(guī)范，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿的起草。征求意見階段（2019年6月-2023年9月）（1）征集意見（2019年6月-2023年9月）將起草的標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿送國內(nèi)11位同行專家評審，其中大專院校專家7位，分別來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、浙江大學(xué)、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，其中包含一位來自寵物醫(yī)院的獸醫(yī)臨床專家（于詠蘭副教授）；科研院所專家4位，分別來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、寧波市禽畜病研究所，其中寧波市禽畜病研究所主要開展家畜、家禽和寵物診療及疾病防控技術(shù)研發(fā)，屬應(yīng)用單位。因此，征求專家的代表性良好。共收到10位專家返還意見，有一位專家未提出具體意見。共征集到意見46條，主要集中在樣品采集、PCR擴(kuò)增、陽性標(biāo)準(zhǔn)對照、范圍、題目等方面。征集到意見46條，其中同意采納44條，占95.65%；未采納2條，占4.35%，對未采納和部分采納者均在備注欄中均做了說明。主要涉及2個方面：（1）是否有必要增加引言，內(nèi)容包括為什么要制定這個標(biāo)準(zhǔn)、裂頭蚴基本概念、裂頭蚴寄生部位等等?？紤]到引言為非必須部分；且綜合其他專家意見，考慮到人和動物裂頭蚴感染早有報道，在人和動物中有一定的流行率；裂頭蚴感染的基本知識在編制說明中已有相關(guān)內(nèi)容，因此，標(biāo)準(zhǔn)文本中就不再介紹。（2）是否可以用構(gòu)建好的含有靶基因序列的質(zhì)粒作為PCR質(zhì)控模板，無須用蟲體作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。此意見與其他專家的觀點(diǎn)不同；同時，樣品DNA提取過程也可能存在誤差，導(dǎo)致提取的DNA質(zhì)量不符合要求，造成擴(kuò)增效果不好。因此，以鑒定正確的裂頭蚴或其片段作為陽性對照，與待檢樣品同時進(jìn)行DNA提取和檢測，可以更好地降低誤操作帶來的結(jié)果不準(zhǔn)確，故沒有采納該建議。（2）修改補(bǔ)充和田間樣品應(yīng)用階段（2019年8月-至今）繼續(xù)從上海、重慶、山東、廣州、浙江采集豬肉、豬血液，以及蛙、蛇等樣品，利用標(biāo)準(zhǔn)所列方法，進(jìn)行檢測，評估各種方法的診斷效果及其敏感性、特異性、重復(fù)性，繼續(xù)優(yōu)化各種診斷方法。3.審查階段（2023年10月-至今）根據(jù)專家意見，結(jié)合田間應(yīng)用結(jié)果、最新公開發(fā)表文獻(xiàn)的學(xué)習(xí)，對標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿進(jìn)行修改，形成標(biāo)準(zhǔn)送審稿，報全國動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAC/TC181）秘書處，進(jìn)行審查。4.報批階段（此次不寫本部分）二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)的編寫原則主要闡述標(biāo)準(zhǔn)制定或修訂過程遵循的基本原則。1、根據(jù)“先進(jìn)性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的標(biāo)準(zhǔn)編制原則，本標(biāo)準(zhǔn)的制定將重點(diǎn)關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)的通用性、適用性和可操作性，并符合我國國情；2、標(biāo)準(zhǔn)的格式嚴(yán)格按照GB/T1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》、GB/T1.2-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第2部分：以ISO/IEC標(biāo)準(zhǔn)化文件為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化文件起草規(guī)則》給出的規(guī)則。（二）提出本標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)主要內(nèi)容包括技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則等。依據(jù)包括試驗和統(tǒng)計數(shù)據(jù)。尤其注意本條不要寫成任務(wù)來源。1、生產(chǎn)需要我國生豬養(yǎng)殖面廣量大，其中中小養(yǎng)殖場/戶占多數(shù)，這些養(yǎng)殖場/戶技術(shù)人員數(shù)量少、缺乏高精尖的儀器設(shè)備。而裂頭蚴病的診斷更多應(yīng)用于屠宰企業(yè)，同樣，屠宰企業(yè)的規(guī)模和技術(shù)水平參差不齊，大多數(shù)的屠宰企業(yè)缺乏專業(yè)的檢測人員和高精尖的儀器設(shè)備。因此，在制定豬裂頭蚴病的診斷標(biāo)準(zhǔn)時，必須要考慮生產(chǎn)企業(yè)的實際，選擇既適合廣大基層使用，又能在大專院校、科研院所使用，確保診斷的準(zhǔn)確性、有效性和先進(jìn)性。2、技術(shù)依據(jù)當(dāng)前，動物源性食品中裂頭蚴的檢測方法主要包括病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。由于跌宮絳蟲裂頭蚴蟲體較大，肉眼即可觀察到。因此，目檢法在生產(chǎn)現(xiàn)場應(yīng)用最廣，尤其適合屠宰企業(yè)在宰后檢疫中運(yùn)用。但目檢法需要檢測人員有一定的鑒別能力和實踐經(jīng)驗，存在較大的主觀性，因此，不能作為確診的方法。而顯微鏡檢法可以顯著彌補(bǔ)這個缺陷，根據(jù)蟲體的體表特征、大小、寄生部位等，可以進(jìn)行確診。以往，國內(nèi)外主要采用該法進(jìn)行動物源性食品中跌宮絳蟲裂頭蚴感染監(jiān)測、調(diào)查；當(dāng)前，國內(nèi)外仍普遍應(yīng)用。但該法無法鑒定裂頭蚴的種類。血清學(xué)診斷方法在豬的生前診斷中發(fā)揮重要作用，目前建立的血清學(xué)方法包括間接血凝技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫印跡技術(shù)、膠體金滲濾法等，這些技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中間接血凝和膠體金滲濾法相對敏感性較低；免疫印跡技術(shù)容易產(chǎn)生非特異性斑點(diǎn)；ELISA法相對敏感、重復(fù)性相對較好，使用比較方便，應(yīng)用相對較多。但是，所有免疫學(xué)方法都存在抗原特異性的問題，現(xiàn)有的裂頭蚴診斷抗原，無論是可溶性抗原、排泄分泌抗原，還是單一重組抗原（其中應(yīng)用較多的是半胱氨酸蛋白酶），與親緣關(guān)系相近的其它蠕蟲，均存在一定程度的交叉反應(yīng)，從而影響了該技術(shù)的應(yīng)用，目前在生產(chǎn)實踐中甚少應(yīng)用。分子生物學(xué)方法可以進(jìn)行裂頭蚴種（系）的區(qū)分，有效地解決這個缺陷，而且具有靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外PCR檢測的靶基因較多，有cox1（ZhuXQetal.,2002;LiuWetal.,2010;YanagidaTetal.,2010;TappeDetal.,2013;BoonyasiriAetal.,2014;ZhangXetal.,2015a;ZhangXetal.,2015b;TangTHetal.,2017;JeonHKetal.,2018;HongXetal.,2020;LiuWetal.,2020;BazsalovicsováEetal.,2022）、核糖體小亞基rRNA（SmallsubunitribosomalRNA,SSUrRNA，也常稱為18SrRNA）（Ko?odziej-SobocińskaMetal.,2014;Ko?odziej-SobocińskaMetal.,2016;ZhangXetal.,2017;KondziorEetal.,2018;KondziorEetal.,2020）、核糖體大亞基rRNA（LargesubunitribosomalRNA,LsrRNA，也常稱為28SrRNA）（ZhangXetal.,2014;MengYetal.,2019）、NADH脫氫酶亞基1（NADHdehydrogenasesubunit1,nad1）、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internaltranscribedspacer,ITS）（LeeSUetal.,1997;DaiRSetal.,2012;NdosiBAetal.,2020）、cox3（TanLetal.,2017）基因等。但基于cox1的PCR方法應(yīng)用最廣，多數(shù)學(xué)者也認(rèn)為其鑒別效果更好（HongXetal.,2020;KuchtaRetal.,2021;BazsalovicsováEetal.,2022;YamasakiHetal.,2024）。申請者所在實驗室，采用基于cox1和nad1基因的PCR方法檢測上海、浙江等地蛙中分離的疑似曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴，發(fā)現(xiàn)均能有效擴(kuò)增，并成功鑒定蟲種（ZhangXetal.,2020）。鑒于上述因素，本標(biāo)準(zhǔn)選擇目檢法和基于cox1部分基因的PCR方法作為動物源性食品中裂頭蚴的檢測方法，可兼顧生產(chǎn)一線和實驗室鑒定使用。（三）新舊標(biāo)準(zhǔn)對比（適用于修訂標(biāo)準(zhǔn)的情況）無。三、主要試驗或驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果（一）主要試驗或驗證的分析1、建立了基于cox1的PCR檢測技術(shù)，分析了其敏感性和特異性；將建立的PCR技術(shù)應(yīng)用于上海、重慶、山東、廣東、浙江豬肉及血清、牦牛肉、蛙等的檢測。其中上海豬肉的總陽性率為0.53%（6/1129），重慶豬肉的總陽性率為0.37%（4/1073），廣東的總陽性率為0.91（6/658）；長三角地區(qū)蛙的總陽性率為4.08（19/466）。2、克隆表達(dá)了曼氏跌宮絳蟲裂頭蚴半胱氨酸蛋白酶（Spirometramansonicysteineprotease,SmCP）的編碼基因，重組SmCP（recombinantSmCP,rSmCP）的大小約為37kDa，主要以包涵體形式存在。表達(dá)產(chǎn)物有良好的反應(yīng)原性，能與小鼠感染血清反應(yīng)。3、利用重組表達(dá)的rSmCP、可溶性蛋白及排泄分泌抗原作為包被抗原，建立了檢測抗體的間接ELISA技術(shù)。對小鼠感染裂頭蚴后的血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠在感染后6d（day6postinfection,D6PI）抗體顯著上升，OD值達(dá)1.2275，至D48PI時達(dá)到最高峰，OD值達(dá)2.214；此后，明顯下降，至D51PI時將至0.552，此后有所回升，在D63PI時達(dá)0.859。4、制備了曼氏跌宮絳蟲裂頭蚴的可溶性抗原；免疫兔子，制備了抗血清；利用間接ELISA技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)新西蘭白兔在首免后，抗體水平迅速上升，二免時達(dá)到0.9左右，三免后抗體水平增長速度放緩。5、采用免疫蛋白組學(xué)技術(shù)，對裂頭蚴診斷抗原進(jìn)行了篩選。結(jié)果，陰性血清檢測發(fā)現(xiàn)存在296個斑點(diǎn)；陽性血清組存在229個斑點(diǎn)，扣除陰性組相同的斑點(diǎn)外，共獲得了20個差異斑點(diǎn)；測定了上述斑點(diǎn)的氨基酸序列，對其中部分斑點(diǎn)的編碼基因序列進(jìn)行了克隆和表達(dá)；利用重組抗原，建立的間接ELISA診斷技術(shù)，目前正在對這些方法進(jìn)行比較和篩選。6、對蛙裂頭蚴感染情況進(jìn)行了檢測。對上海閔行、江蘇海門、浙江嘉興等區(qū)采集的386只蛙進(jìn)行檢測，供發(fā)現(xiàn)陽性蛙19只，陽性率4.92%，分離獵頭與蟲體27條。利用基于cox1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)的蟲體均為曼氏跌宮絳蟲裂頭蚴。其中，上海閔行、浙江嘉興采集的56只蟾蜍，上海閔行、奉賢采集的12只牛蛙，上海奉賢采集的30只水雞，浙江嘉興采集的11只石蛙進(jìn)行檢測，均發(fā)現(xiàn)陽性。7、建立了曼氏跌宮絳蟲裂頭蚴小鼠感染模型。利用分離的裂頭蚴3條感染小鼠，120d后收獲蟲體2條，長度由感染時的1.0cm成長為10cm。分4批次，分別用1、2、3、4個裂頭蚴頭節(jié)接種6只、1、1、5只小鼠，其中感染1條的部分小鼠死亡，其余在181d收到1條蟲體。感染2、3個頭節(jié)的分別在325d、156d后各收獲2條蟲體，長度是原先的10倍~20倍。但感染4條的小鼠全部死亡。小鼠在感染后2w時，嗜酸性細(xì)胞含量達(dá)到最高峰，此后逐漸下降。比較分析發(fā)現(xiàn)，建立的PCR技術(shù)和間接ELISA技術(shù)的敏感性和特異性良好。將PCR技術(shù)應(yīng)用于上海、重慶、山東、廣東、浙江豬肉及血清、牦牛肉、蛙等的檢測，其中上海豬肉的總陽性率為0.53%（6/1129），重慶豬肉的總陽性率為0.37%（4/1073），廣東的總陽性率為0.91%（6/658）；長三角地區(qū)蛙的總陽性率為4.08%（19/466），效果良好。（二）綜述報告1、裂頭蚴嚴(yán)重影響動物性食品安全，給人類健康造成重大威脅裂頭蚴的危害隨其寄生部位的不同而不同，眼裂頭蚴病最常見，可引起眼臉紅腫、結(jié)膜充血、微痛、奇癢有蟲爬感、畏光、流淚，有時伴發(fā)熱、惡心和嘔吐，眼球運(yùn)動障礙，嚴(yán)重者視角膜潰瘍、并發(fā)白內(nèi)障而失明；皮下裂頭蚴病導(dǎo)致皮下結(jié)節(jié)、瘙癢、炎癥、觸痛或持續(xù)疼痛；口腔頜面裂頭蚴病寄生處紅腫、發(fā)癢、有硬結(jié)；腦脊髓裂頭蚴病主要癥狀有癲癇樣發(fā)作（占70%），肢體發(fā)作性不自主抽搐、進(jìn)行性頭痛（占20%）、肢體麻木，進(jìn)行性肌無力或偏癱（占50%）等，后果嚴(yán)重；內(nèi)臟裂頭蚴病可引起呼吸道咳血、消化道炎癥、尿道或膀胱炎癥。裂頭蚴病呈世界性分布，亞洲常有人患病的報道，如日本、韓國、朝鮮、印尼、菲律賓、馬來西亞、越南等；歐洲、北美、南美、非洲也有病例報道，包括俄羅斯等，目前全球病例超過1600例。我國有1300多例，分布于全國31個?。▍^(qū)、市），尤以南方省區(qū)多見；0~85歲均可感染，其中10~30歲年齡組的感染率最高。近年來，曼氏裂頭蚴病的發(fā)病率呈上升趨勢，尤其腦脊髓裂頭蚴病的比例明顯增高，成為我國重要的人獸共患食源性寄生蟲病之一。此外，增值型裂頭蚴?。╬roliferativesparganosis）病例也與普通裂頭蚴病一樣在東亞、拉美國家散發(fā)，目前，世界上至少報道了16例增值型裂頭蚴病病例，其中日本6例，中國4例，泰國2例，美國、巴拉圭、委內(nèi)瑞拉和菲律賓各1例。而其成蟲在人體也有寄生的報道，主要分布在日本、韓國、俄羅斯等少數(shù)國家，我國報道的至少有20多例，分布在廣東、臺灣、四川和福建等省市，感染者從3歲至58歲均有。在上海，諸葛傳德（1990）、楊亢清等（1992）、潘力等（1994）、朱道韞等（1998）分別報道了1、1、1和2例曼氏裂頭蚴病例。人的感染途徑主要有兩種，其一是寄生于第二中間宿主蛙中寄生的裂頭蚴，或寄生于第一中間宿主劍水蚤中的蟲體原尾蚴經(jīng)皮膚或黏膜侵入，這主要是由于我國部分地區(qū)流行蛙有清涼解毒作用的傳說，常有人將生的青蛙肉敷貼在傷口，包括眼睛、口等處，蛙肉中寄生的裂頭蚴即可經(jīng)傷口或皮膚、黏膜侵入；其二是生食或半生食蛙、蛇、豬、馬、雞肉等，將其中寄生的裂頭蚴食入，或通過飲用生水、游泳時誤喝了河水，導(dǎo)致攜帶病原的第一中間宿主劍水蚤進(jìn)入體內(nèi)而感染。2、缺乏針對動物性食品的標(biāo)準(zhǔn)化的檢測技術(shù)目前，裂頭蚴的檢測主要依賴于肉眼觀察和顯微鏡檢查，實驗室常采用PCR等分子方法。此外，也已經(jīng)發(fā)展了一些用于人感染后抗體檢測的免疫學(xué)方法，包括以分泌排泄蛋白為檢測抗原的ELISA、免疫印跡試驗（Westernblot），以及以可溶性蛋白為抗原的斑點(diǎn)免疫金滲濾法（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA），但市場上尚缺乏商品化、質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑盒。3、我國動物食品裂頭蚴檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)缺乏，嚴(yán)重影響食品的質(zhì)量和安全我國目前實施的裂頭蚴領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，僅有發(fā)布于2013年的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《裂頭蚴病的診斷》（編號WS438-2013），用于全國各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)對人體裂頭蚴病的診斷；《裂頭絳蟲幼蟲檢測》（WS/T571-2017），用于魚、蛙和蛇中裂頭絳蟲幼蟲的檢測。但人裂頭蚴病診斷標(biāo)準(zhǔn)不適合動物源性食品中裂頭蚴的檢測，水產(chǎn)品中寄生蟲的檢驗技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)也不適合畜禽等動物。迄今尚缺乏有關(guān)畜禽，尤其是動物源性食品中跌宮絳蟲裂頭蚴的檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，用于指導(dǎo)、規(guī)范現(xiàn)場和實驗室的檢測；動物以及動物源性食品中裂頭蚴污染的田間調(diào)查甚少，導(dǎo)致：（1）我國裂頭蚴中間宿主和轉(zhuǎn)續(xù)宿主感染的數(shù)據(jù)、資料極其匱乏；（2）不同調(diào)查人員采用不同的方法，所得結(jié)果缺乏可比性；（3）對動物源性食品中裂頭蚴的存在情況掌握不清，對其危害性缺乏認(rèn)識，從而使人感染的數(shù)量持續(xù)增加。（三）技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證通過比較和優(yōu)化，建立了適用于豬、禽、蛙、蛇等動物肌肉、脂肪等組織中攜帶的跌宮絳蟲裂頭蚴檢測用的目檢法、顯微鏡檢法、PCR檢測法。將這些方法應(yīng)用于上海、重慶、廣州屠宰場采集的1129份、1073、658份樣品的檢測，結(jié)果分別發(fā)現(xiàn)陽性樣品6、4、6份，陽性率分別為0.53%、0.37%、0.91%。詳細(xì)見表1。表1上海、重慶、廣州屠宰場豬膈肌裂頭蚴PCR檢測采樣省份日期地區(qū)樣品數(shù)量曼氏裂頭蚴陽性數(shù)陽性率（%）上海2015年9-10月奉賢3425.88嘉定6334.76松江3000.00小計12753.942016年1月奉賢愛森3000.00嘉定五豐3000.00農(nóng)貿(mào)市場4200.00小計10200.002016年7月奉賢愛森3000.00嘉定五豐3000.00嘉定裕農(nóng)3000.00農(nóng)貿(mào)市場3013.33超市3000.00小計15010.672016年10月奉賢愛森3000.00嘉定五豐3000.00奉賢深藍(lán)3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00超市3000.00小計15000.002017年3月奉賢愛森3000.00嘉定五豐3000.00奉賢申蘭3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00超市3000.00小計15000.002017年12月奉賢愛森3000.00嘉定五豐3000.00奉賢申蘭3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00超市3000.00小計15000.002018年4月奉賢愛森3000.00嘉定五豐3000.00松江松林3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00超市3000.00小計15000.002018年7月奉賢愛森3000.00嘉定五豐3000.00松江松林3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00超市3000.00小計15000.00合計112960.53重慶2015年9月大渡口4336.98九龍坡4412.27渝北8600.00小計17342.312016年7月渝北華牧3000.00渝北旺峰3000.00南岸長生3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00超市3000.00小計15000.002016年10月渝北華牧3000.00祥旭3000.00滕馳3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00超市3000.00小計15000.002017年4月重慶華牧3000.00重慶旺峰3000.00重慶北碚3000.00重慶超市3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00小計15000.002017年11月重慶華牧3000.00重慶旺峰3000.00重慶九龍坡3000.00重慶超市3300.00農(nóng)貿(mào)市場2700.00小計15000.002018年4月重慶華牧3000.00重慶旺峰3000.00重慶九龍坡3000.00重慶超市3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00小計15000.002018年7月重慶華牧3000.00重慶旺峰3000.00重慶九龍坡3000.00重慶超市3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00小計15000.00合計107340.37廣州2015年10月白云6023.33花都6046.67小計12065.002017年7月嘉禾3000.00天河3000.00花都寶源2800.00茅山3000.00小計11800.002017年10月嘉禾3000.00天河3000.00花都寶源3000.00茅山3000.00小計12000.002018年7月孔旺記9000.00超市3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00小計15000.002018年10月孔旺記9000.00超市3000.00農(nóng)貿(mào)市場3000.00小計15000.00合計65860.91為了解上海及周邊地區(qū)市售蛙類裂頭蚴感染情況及其種類，于2017年5月-2019年6月在上海市閔行區(qū)、松江區(qū)和奉賢區(qū)，江蘇省的海門市和南通市通州區(qū)，以及浙江省嘉善縣的農(nóng)貿(mào)市場購買蛙類，解剖、分離裂頭蚴，記錄陽性率、寄生部位及蟲體長度；用體式顯微鏡觀察蟲體運(yùn)動情況；用蘇木素染色后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；提取裂頭蚴基因組DNA，PCR擴(kuò)增cox1基因并進(jìn)行序列系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果共檢測386只蛙，分屬澤陸蛙（Fejervaryamultistriata）、黑斑蛙（Pelophylaxnigromaculatus）、牛蛙（Lithobatescatesbeiana）、棘胸蛙（Quasipaaspinosa）及中華大蟾蜍（Bufogargarizans），裂頭蚴的總陽性率為4.92%（19/386），最大感染強(qiáng)度為11條/只，其中黑斑蛙感染率為7.74%（13/168），澤陸蛙感染率為6.32%（6/95），其他蛙類未檢測到裂頭蚴，5種蛙的感染率差異不顯著（p>0.05）（表2）。感染率最高的地區(qū)是海門市，達(dá)10.84%，接著是閔行區(qū)、奉賢區(qū)、松江區(qū)、通州區(qū)，最低是嘉善縣，分別為9.52%、8.70%、6.67%、3.33%和0，城市間感染率差異不顯著（p>0.05）（表3）。累計獲得39條裂頭蚴，長度在0.2cm-7.0cm之間，頭節(jié)平均長寬為0.2mm和1.5mm，形態(tài)上類似曼氏裂頭蚴，其中76.47%的蟲體寄生于四肢骨骼肌中，11.76%寄生于背脊肌肉中（圖1），二者差異極顯著（χ2=21.048，p<0.001）。裂頭蚴形態(tài)與文獻(xiàn)報道的曼氏跌宮絳蟲裂頭蚴近似（圖2）。39條裂頭蚴部分cox1和nad1基因序列長度一致分別為418~448bp和625~657bp，經(jīng)BLAST分析，與GenBank中曼氏裂頭蚴的序列一致性>90%（GenBank登錄號：MG762084、KY009916）；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，長三角地區(qū)分離的裂頭蚴cox1和nad1基因序列與國內(nèi)其他地區(qū)報道的曼氏跌宮絳蟲裂頭蚴（2022年前曾錯誤地判定為歐猥跌宮絳蟲裂頭蚴）在一個分枝上（圖3-4）。上述結(jié)果提示，上海及周邊地區(qū)市售黑斑蛙和澤陸蛙存在曼氏裂頭蚴感染，寄生部位主要在肌肉中，尤其是后腿肌肉，人們食用蛙肉時應(yīng)注意飲食安全。表2不同種類蛙裂頭蚴感染情況Table2PrevalenceofSpirometrasparganumin5speciesofAnura蛙的種類SpeciesofAnura樣品數(shù)量No.Sample陽性數(shù)（陽性率）No.Positive(Positiverate)感染強(qiáng)度（每只蛙的感染數(shù)）Infectionintensity(Spargana/frog)裂頭蚴總數(shù)No.sparganum95%置信區(qū)間95%CI澤陸蛙Fejervaryamultistriata956(6.32%)ac1-392.35-13.24黑斑蛙Rananigromaculata16813(7.74%)a1-11304.18-12.87蟾蜍Bufogargarizans560(0)bc000-6.38Ranaspinosa410(0)ac000-8.60石蛙Lithobatescatesbeiana260(0)ac000-13.23合計Total38619(4.92%)1-11392.99-7.58Note:Samelowercaseletterwithincolumnsrepresentednosignificantdifferencesbetweengroups;differentlowercaseletterwithincolumnsrepresentedsignificantdifferencesbetweengroups(p>0.05).表3不同區(qū)蛙裂頭蚴感染情況Table3PrevalenceofSpirometrasparganainfrogs(F.multistriataandR.nigromaculata)地區(qū)Locations樣品數(shù)No.Sample陽性數(shù)No.Positive感染強(qiáng)度Infectionintensity(Spargana/frog)裂頭蚴總數(shù)No.Sparganum95%置信區(qū)間95%CI上海Shanghai閔行Minhang424(9.52%)a1-362.66-22.62奉賢Fengxian232(8.70%)a1-231.07-28.04松江Songjiang302(6.67%)a1-230.82-22.07小計Total958（8.42%）123.71-15.92江蘇Jiangsu海門Haimen839(10.84%)a1-11255.08-19.59通州Tongzhou602(3.33%)a120.41-11.53小計Total14311（7.69%）273.90-13.35浙江Zhejiang嘉善Jiashan250(0)a000-13.72Total26319(7.22%)1-11394.41-11.05Note:Samelowercaseletterwithincolumnsrepresentnosignificantdifferencesbetweengroups(p>0.05).圖1青蛙體內(nèi)迭宮絳蟲裂頭蚴寄生位置Fig1ParasitesitesofSpirometrasparganainfrogsA-F：寄生于蛙腿骨骼肌的裂頭蚴；A：呈棉線狀的寄生蠕蟲；B：剝離肌纖維后，伸出的裂頭蚴頭節(jié)；C：寄生部位有出血現(xiàn)象；D：寄生于同側(cè)大腿肌肉上的兩個裂頭蚴，一個呈線性折疊，一個呈卷曲狀；E：寄生于兩只大腿肌肉中；F：三條裂頭蚴均寄生于同一側(cè)邊，且長度不同；G：一條寄生在背肌上的裂頭蚴，呈卷曲狀；H：寄生于皮下的裂頭蚴，頭部嵌入腹壁肌肉中A-F:Sparganaparasitizedintheskeletalmuscleoffrogthigh;A:showedclearlycotton-likeparasiticworm;B:showedthatspargana’sscolexwasextrudedafterstrippingmusclefibers;C:showedparasiticsitehadbleedingphenomenon;D:twosparganasparasitizedintheipsilateralthighmusclewithonelinearfoldandonecurlup;E:sparganaparasitizedonboththighs;F:showedthreesparganiawereparasitizedonthesamesidewithdifferentlengths.G:onesparganaparasitizedinthedorsalmuscle,whichwascurledup.H:sparganaundersubcutaneouswithitsheadknotstiedintotheabdominalwallmuscles.圖2立體顯微鏡下裂頭蚴的形態(tài)特征Fig2MorphologicalcharacteristicsofsparganaunderstereomicroscopeA：顯示裂頭蚴對蛙肉具有趨向性；B：是由于裂頭蚴的收縮而產(chǎn)生的不同細(xì)度的頭節(jié)；C：蘇木精染色后，節(jié)段頂部凹陷，小葉中央有間隙；D：裂頭蚴頭節(jié)A:Showedthatsparganumhadthechemotaxistofrogmeat.B:Thescolexwithdifferentfinenessbecauseofsparganum’sshrinking.C:TherewasadepressionatthetopofthescolexandagapinthemiddleofthestrobilaafterstainingbyHematoxylin.D:Thescolexofsparganum圖3裂頭蚴cox1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（鄰接法）Fig3PhylogeneticrelationshipsamongmembersofcestodeinferredbyNeighbor-Joininganalysisusingthepartialsequenceofthemitochondrialcytochromecoxidasesubunit1gene(cox1),withD.nihonkaienseasoutgroup.圖4裂頭蚴nad1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（鄰接法）Fig4PhylogeneticrelationshipsamongmembersofcestodeinferredbyNeighbor-JoininganalysisusingthepartialsequenceoftheNADHdehydrogenasesubunit1(nad1)gene,withD.nihonkaienseasoutgroup.同時，研制了一種同時檢測豬肉中曼氏裂頭蚴、旋毛蟲、豬囊尾蚴、剛地弓形蟲等4種食源性寄生蟲的多重PCR方法，多重PCR可分別有效檢出1.15pg/μL濃度的旋毛蟲、1.03ng/μL濃度的剛地弓形蟲、0.56pg/μL濃度的豬囊尾蚴、1.20ng/μL濃度的曼氏裂頭蚴的DNA。結(jié)果只有弓形蟲、旋毛蟲、豬囊尾蚴、曼氏裂頭蚴有擴(kuò)增條帶，而日本血吸蟲、微小隱孢子蟲、柔嫩艾美耳球蟲、細(xì)粒棘球絳蟲無擴(kuò)增條帶。將建立的技術(shù)應(yīng)用于田間樣品，對廣州、上海、重慶采集的120、127、173份田間豬膈肌樣品，進(jìn)行多重PCR檢測。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)豬囊尾蚴陽性樣品17份，陽性率4.05%；旋毛蟲陽性樣品1份，陽性率0.24%；曼氏裂頭蚴陽性樣品15份，陽性率3.57%；393份樣品中，弓形蟲陽性樣品21份，陽性率5.34%。（四）預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果我國是世界畜牧業(yè)大國，2021年，我國肉類總產(chǎn)量8990.0萬噸，其中，豬肉產(chǎn)量5295.9萬噸，居世界第一；年末生豬存欄44922.4萬頭，肉豬出欄67128.0萬頭，居世界第一位，約占世界總量的一半。年飼養(yǎng)家禽近百億只。此外，蛙（包括虎紋蛙、棘胸蛙、中國林蛙、牛蛙、豬蛙等）、蛇（包括眼鏡蛇、眼鏡王蛇、滑鼠蛇、灰鼠蛇、蟒蛇、烏梢蛇等）等特種養(yǎng)殖業(yè)近年來也有了迅速發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計，我國年食用活蛇達(dá)20000噸，約1500萬條；僅廣州市一地，單月消費(fèi)活蛇達(dá)600噸，年銷量達(dá)8000噸。另外，藥用、工藝及觀賞用蛇數(shù)量也非常驚人。據(jù)《中國中藥資源》稱,我國僅蘄蛇藥材的年需求量為50000～60000kg。而蛙類，僅黑龍江省野生和養(yǎng)殖的林蛙總量達(dá)4.5億只，其中野生種蛙720萬只，農(nóng)墾林蛙馴養(yǎng)中心存欄8000萬只，鐵力市養(yǎng)殖成品蛙2400萬只，興隆林業(yè)局存欄1500萬只以上；吉林延邊林區(qū)林蛙養(yǎng)殖戶就有3263戶，年產(chǎn)成品蛙5331萬只，產(chǎn)值17481萬元。而這些動物源性食品、藥材中裂頭蚴的感染率又較高。隨著人們保健意識的增強(qiáng)，以及對裂頭蚴危害了解的增加，必然要求加強(qiáng)動物源性食品中裂頭蚴污染情況的調(diào)查。因此，動物源性食品中裂頭蚴檢測技術(shù)擁有廣闊的市場前景，一旦技術(shù)經(jīng)商業(yè)化推廣應(yīng)用后，其經(jīng)濟(jì)效益和社會效益將極其顯著。四、采用國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國際、國內(nèi)同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對比情況，或與測試的國外樣品有關(guān)數(shù)據(jù)對比情況如前所述，當(dāng)前，動物源性食品中裂頭蚴的檢測方法主要包括病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。由于跌宮絳蟲裂頭蚴蟲體較大，肉眼即可觀察到。因此，目檢法在生產(chǎn)現(xiàn)場應(yīng)用最廣，尤其適合屠宰企業(yè)在宰后檢疫中運(yùn)用。但目檢法需要檢測人員有一定的鑒別能力和實踐經(jīng)驗，存在較大的主觀性，因此，不能作為確診的方法。而顯微鏡檢法可以顯著彌補(bǔ)這個缺陷，根據(jù)蟲體的體表特征、大小、寄生部位等，