6-姜酚誘導(dǎo)k562細(xì)胞凋亡的差異表達(dá)蛋白的研究

6-姜酚誘導(dǎo)k562細(xì)胞凋亡的差異表達(dá)蛋白的研究

根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，姜酚具有抗炎、抗?jié)儭⒖菇M胺等藥理活性，并報(bào)告了許多關(guān)于腫瘤作用的報(bào)告。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)6-姜酚能顯著抑制慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但其確切作用機(jī)制尚不明確。目前關(guān)于姜酚抗腫瘤作用機(jī)制的研究?jī)H限于個(gè)別基因或蛋白質(zhì),在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上的報(bào)道很少。自1995年澳大利亞學(xué)者首先提出蛋白質(zhì)組(Proteome)的概念,近年蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)技術(shù)日益用于尋找篩選抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的研究,可動(dòng)態(tài)、整體、定量地從整體水平研究蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律,比較分析藥物作用腫瘤細(xì)胞前后的蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異,確定藥物作用靶位。本研究比較了6-姜酚作用K562細(xì)胞后差異蛋白質(zhì)譜變化,試圖從蛋白組水平探討其抗白血病的機(jī)制。1材料和機(jī)器1.1細(xì)胞植物K562細(xì)胞,由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2蛋白質(zhì)藥物活性測(cè)試6-姜酚參照文獻(xiàn)制成高純度簇狀姜酚結(jié)晶(經(jīng)質(zhì)譜、核磁共振氫譜、紫外光譜、紅外光譜等證實(shí)為姜酚),用分析純DMSO溶解配制成5.5μg/mL溶液備用;RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco);小牛血清(杭州四季青公司);固相pH梯度干膠條、IPG緩沖液、覆蓋液、溴酚藍(lán)(AmershamBiosciences),BSA、DNaseⅠ(GE),蛋白酶抑制劑PMSF、低熔點(diǎn)瓊脂糖、過(guò)硫酸胺、TEMED、DMSO(Sigma),G-250染色液(Bio-Rad),胰蛋白酶(Promega)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3儀器、檢測(cè)方法IPGphor等電聚焦儀;EttanDALT垂直電泳槽;ImageScanner掃描儀;核酸蛋白測(cè)定儀(GE);PowerPAC1000電泳儀;4800MALDI-TOF/TOF串聯(lián)時(shí)間飛行質(zhì)譜(ABI);MILLIPORE純水系統(tǒng)(MilliPore);蛋白核酸干燥儀(德國(guó)Thermo)及流式細(xì)胞儀(CoulterElite)。1.4分析方法及數(shù)據(jù)庫(kù)查詢軟件Labsean掃描軟件、DataExplorer質(zhì)譜分析軟件(美國(guó)AppliedBiosystem);ImageMaster2DPlatinum雙向凝膠圖譜分析軟件(瑞典AmershamBiosciences);MascotMS/MS數(shù)據(jù)庫(kù)查詢軟件(英國(guó)Matrixscience);PDQusst凝膠圖像分析軟件(Bio-Rad)。2方法2.1rpmi-1330細(xì)胞培養(yǎng)K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、臺(tái)盼藍(lán)拒染>95%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.2增殖抑制率測(cè)定3×104/mLK562細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,終體積200μL/孔,設(shè)3復(fù)孔,6-姜酚設(shè)5個(gè)濃度(2.5、5、10、15、20μg/mL)。37℃、5%CO2培養(yǎng)48、72h后,每孔加入10μLCCK-8試劑,孵育1h,酶標(biāo)儀測(cè)光密度D(λ)值(測(cè)定波長(zhǎng)450nm,參比波長(zhǎng)655nm),計(jì)算各組增殖抑制率。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取其均值。增殖抑制率(%)=1?D(λ)實(shí)驗(yàn)組D(λ)對(duì)照組×100%(%)=1-D(λ)實(shí)驗(yàn)組D(λ)對(duì)照組×100%2.36細(xì)胞總蛋白的測(cè)定6-姜酚半數(shù)抑制量處理K562細(xì)胞48h,收集細(xì)胞,加細(xì)胞裂解液吹打混勻,4℃振蕩30min,4℃、13200r/min離心30min,取上清即為細(xì)胞總蛋白。按Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。-70℃保存?zhèn)溆谩?.4sds-東南角電泳第一向采用固相pH梯度等電聚焦電泳。將200μg蛋白質(zhì)樣品與樣品水化液充分混勻加入水化槽中,總量250μL。按以下程序進(jìn)行等點(diǎn)聚焦,總時(shí)間約為22h(30V,12h;500V,1h;1000V,1h;8000V,8h;2000V,10h)。雙向電泳采用SDS。將平衡結(jié)束的膠條置于SDS凝膠上端,4℃、10mA,電泳30min后電流增至20mA,電泳至溴酚藍(lán)前沿距凝膠底部115mm處停止。Step1,15mA/膠條,15min;Step2,30mA/膠條,電泳約4h。2.5染色將凝膠轉(zhuǎn)移到染色盒里固定,采用快速銀染法染色。2.6點(diǎn)的匹配點(diǎn)、點(diǎn)的編碼將染色后的2-DE圖譜掃描入計(jì)算機(jī),用ImageMaster2DPlatinum進(jìn)行圖像分析。通過(guò)檢測(cè)膠上點(diǎn)的位置、大小、點(diǎn)的灰度值,將膠的點(diǎn)數(shù)字化,分析膠間的匹配點(diǎn),將各分析膠上相同位置上點(diǎn)的差異以倍數(shù)的形式顯示出來(lái)。將3次重復(fù)加姜酚作用前后的K562細(xì)胞共6張銀染凝膠圖譜用圖像分析軟件ImageMaster2DPlatinum進(jìn)行成組比較,選擇差異在2倍以上且重復(fù)性好的蛋白質(zhì)點(diǎn)作為候選差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。2.7肽指紋圖譜的鑒定切下初步篩選出的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn),用4800MALDITOF/TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定。從GPSExplorer軟件(V3.6,AppliedBiosystems)得到MS和MS/MS的數(shù)據(jù),搜索IPI數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù)。得分(MS和MS/MS聯(lián)合)超過(guò)65被認(rèn)為超過(guò)閾值(P≤0.05),為可信的鑒定結(jié)果。2.8差異是通過(guò)氨基酸功能分類和氨基酸相互作用網(wǎng)絡(luò)圖確定的將差異表達(dá)蛋白質(zhì)通過(guò)PANTHER系統(tǒng)功能分類,用STRING(基因/蛋白質(zhì)相互作用檢索工具)繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。2.9統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以SPSS11.0軟件分析,數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,兩組間比較用t檢驗(yàn),多組間比較用多因素方差分析。3環(huán)境生物活性成分的檢測(cè)表觀和蛋白點(diǎn)分析3.16-姜酚對(duì)K562細(xì)胞增殖活性的影響不同濃度的姜酚在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)K562細(xì)胞均有顯著的增殖抑制效果,且呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系,其中72h的增殖抑制效果較48h強(qiáng)(圖1)。0.5%DMSO對(duì)照組在48、72h的增殖抑制率分別為(2.7±0.65)%、(4.5±0.56)%,與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P﹥0.05)。不同濃度的姜酚處理組與DMSO組比較差異顯著(P﹤0.01)。3.26-姜酚處理前后K562細(xì)胞的雙向電泳結(jié)果結(jié)果如圖2所示,3次雙向凝膠電泳分離,銀染顯色后得到2種pH梯度背景清晰、分辨率高、重復(fù)性好的2-DE各3塊。用ImageMaster2DPlatinum圖像分析軟件分析。進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)。在每塊膠上選擇相同位置且顯著的點(diǎn)作為標(biāo)志點(diǎn)(landmark),根據(jù)標(biāo)志點(diǎn)位置,對(duì)圖像進(jìn)行匹配分析。選擇差異倍數(shù)大于2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)。3.3質(zhì)譜分析結(jié)果取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),通過(guò)膠內(nèi)原位酶解進(jìn)行MALDI-TOF-MS肽指紋圖測(cè)定。結(jié)合雙向凝膠電泳相應(yīng)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表觀等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量、匹配片段的多少以及氨基酸序列的覆蓋率進(jìn)行鑒定,共鑒定出42個(gè)差異表達(dá)蛋白,選擇其中35個(gè)非重復(fù)性差異蛋白分析,結(jié)果表明19個(gè)高表達(dá),16個(gè)低表達(dá),涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白及細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白。有意義的上調(diào)及下調(diào)的差異蛋白見表1～3。其中下調(diào)表達(dá)的AHSA1(HSP90ATP同工酶的激活劑)及SAE1(泛素類家族成員)的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果見圖3、4。4姜酚對(duì)k562細(xì)胞的作用機(jī)制在于其提高1986年,Hanash等開始應(yīng)用2-DE技術(shù)進(jìn)行白血病蛋白質(zhì)組研究,證實(shí)急淋兒童外周血或者骨髓的原始淋巴細(xì)胞分化有關(guān)的多肽(小分子蛋白質(zhì)片段)特性;近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者也開始將蛋白組學(xué)技術(shù)用于白血病研究。Cui等應(yīng)用2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS與ESI-MS/MS分析急性白血病骨髓,發(fā)現(xiàn)不同F(xiàn)AB分型的白血病有各自明確的蛋白質(zhì)表達(dá)特性。田帥等發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)緩解治療前的白血病細(xì)胞差異蛋白質(zhì)表達(dá)水平與其預(yù)后有關(guān),白血病復(fù)發(fā)時(shí)骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)有變化。但目前在蛋白質(zhì)水平探討抗白血病藥物作用機(jī)制的研究剛起步,少數(shù)研究主要圍繞維甲酸耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞的差異蛋白表達(dá),以及維甲酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒系和單核系分化時(shí)的蛋白組差異表達(dá),其它抗白血病藥物的報(bào)道尚少。生姜是植物姜(ZingiberofficinaleRoscoe)的新鮮根莖,姜酚從生姜中提取,是生姜的主要生物活性成分,因其來(lái)源廣泛、價(jià)廉、安全而備受關(guān)注。已有體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示其具有抗腫瘤活性,如皮膚癌、消化道腫瘤、泌尿系腫瘤、乳腺癌等,也有報(bào)道可抑制人白血病HL-60細(xì)胞的DNA合成和活性。本實(shí)驗(yàn)顯示不同濃度的姜酚在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)K562細(xì)胞均有顯著的增殖抑制效果,且呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系;6-姜酚作用K562細(xì)胞后可引起35種蛋白差異非重復(fù)表達(dá),其中19個(gè)高表達(dá),16個(gè)低表達(dá),如AHSA1(Activatorof90kDaheatshockproteinATPasehomolog1)即熱休克蛋白90(HSP90)ATP酶同系物的激活劑、蛋白質(zhì)生物合成與代謝蛋白,包括真核翻譯起始因子3G、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子1-γ、tRNA合成酶及泛素化類活化酶(EIA)等,蛋白丙酮酸激酶,琥珀酸脫氫酶,NADH-泛醌氧化還原酶等,功能涉及氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)生物合成及糖代謝等重要蛋白及蛋白酶,提示上述多個(gè)蛋白可能在多個(gè)環(huán)節(jié)或途徑促使K562細(xì)胞對(duì)姜酚敏感,從而影響白血病細(xì)胞凋亡或存活;這也許正是6-姜酚抗白血病的多靶點(diǎn)作用機(jī)制。其中低表達(dá)蛋白中,AHSA1屬于AHA1家族,是一種ATP依賴性的分子伴侶,包含在突變,穩(wěn)定/退化過(guò)程中,具有致廇功能,主要功能是激活HSP90ATP酶活性,HSP90為線粒體分子伴侶(molecularchaperone),幫助蛋白跨越內(nèi)膜及維持蛋白的特定構(gòu)象,短暫參與蛋白質(zhì)合成后非共價(jià)折疊,組裝或非組裝其他的多肽或RNA分子,參與運(yùn)輸或加工處理低聚物,參與應(yīng)激狀態(tài)引起的蛋白分子的重新組裝和重新折疊及RNA分子的變性,參與蛋白的成熟、穩(wěn)定、降解及其功能發(fā)揮。ATP水解可驅(qū)動(dòng)HSP90形成多肽鏈復(fù)合物從而發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)抑制AHA1表達(dá)可導(dǎo)致客戶蛋白(clientproteins)表達(dá)缺失,增強(qiáng)HSP90對(duì)HSP90抑制劑的敏感性。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜酚降低K562細(xì)胞線粒體跨膜電位(ΔΨm),誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡。本實(shí)驗(yàn)顯示姜酚下調(diào)K562細(xì)胞內(nèi)AHSA1表達(dá),提示其作用靶點(diǎn)可能為通過(guò)線粒體途徑抑制AHSA1,從而抑制白血病細(xì)胞生存。低表達(dá)的另一蛋白SAE1是泛素相關(guān)小修飾蛋白(蘇素)(smallubiquitin-relatedmodifier,SUMO)激活酶亞單位1(SUMO-activatingenzymesubunit1)。SUMO屬于泛素類家族成員,通過(guò)一系列酶降解步驟:涉及SAE1而激活;涉及SAE2(Ubc9,ubiquitin-conjugatingenzyme9)而結(jié)合;通過(guò)Ubc9和及E3蛋白連接酶的結(jié)合而修飾底物。SUMO異構(gòu)體的穩(wěn)定與其兩個(gè)亞單位SAE1及SAE2密切相關(guān),一些外來(lái)毒性蛋白如腺病毒Gam1對(duì)SAE2的效應(yīng)是由于SAE1蛋白酶體降解使SAE2活性不穩(wěn)定而加速泛素化及降解。姜酚下調(diào)K562細(xì)胞內(nèi)SAE1表達(dá),提示姜酚可通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitinpro