CART技術(shù)及腫瘤精準(zhǔn)免疫治療

CAR-T技術(shù)與腫瘤精確免疫治療本文由愛康得生物原創(chuàng)1月20日，美國總統(tǒng)奧巴馬在國情咨文演講中提出“精確醫(yī)學(xué)計(jì)劃”，一時(shí)間“精確醫(yī)療”成為一大熱門詞匯。在美國，精確醫(yī)療稱為“PrecisionMedicine”，而早在百余年前的中國，中醫(yī)就提出了“精確醫(yī)療”這一概念，稱為“辯證施治”。腫瘤又被稱為多基因疾病，其發(fā)病機(jī)理，疾病發(fā)展過程，疾病病癥與體現(xiàn)在個(gè)體之間差存在異。腫瘤的發(fā)生因素很復(fù)雜，遺傳因素，外環(huán)境與內(nèi)環(huán)境以及體細(xì)胞與干細(xì)胞的DNA損傷與修復(fù)，造成基因突變的逐步積累，最后演變?yōu)槎鄠€(gè)癌癥的發(fā)生（圖1）。腫瘤發(fā)生的機(jī)理如基因突變，逆分化，腫瘤干細(xì)胞，免疫監(jiān)視，端粒與端粒酶等等尚有太多的未知領(lǐng)域。這些錯綜復(fù)雜的因素造成相似組織器官癌癥引發(fā)的機(jī)理不一致，相似機(jī)理引發(fā)的癌癥部位不一致。腫瘤的發(fā)生往往有數(shù)千個(gè)突變類型，每個(gè)病人的突變類型不同，因此傳統(tǒng)的治療模式出現(xiàn)了許多困惑，如無法解釋的耐藥性，腫瘤基因組的異質(zhì)性，有效治療響應(yīng)監(jiān)測手段的缺少等，在此時(shí)，精確治療對于腫瘤的治療十分重要。圖1：腫瘤發(fā)生的復(fù)雜性。腫瘤的發(fā)生因素很復(fù)雜，遺傳因素，外環(huán)境與內(nèi)環(huán)境以及體細(xì)胞與干細(xì)胞的DNA損傷與修復(fù)，造成基因突變的逐步積累，最后演變?yōu)槎鄠€(gè)癌癥的發(fā)生。腫瘤精確免疫治療發(fā)展現(xiàn)在，廣泛用于腫瘤精確免疫治療的藥品為靶向藥品和單克隆抗體，其運(yùn)用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子生物學(xué)上的差別（涉及基因、酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同特性），克制腫瘤細(xì)胞的生長增殖，最后使其死亡。如用于治療非小細(xì)胞肺癌的易瑞沙和特羅凱，用于治療大腸癌的西妥昔單抗，用于治療乳腺癌的曲妥珠單抗，用于治療前列腺癌伊馬替尼等。但腫瘤細(xì)胞十分狡猾，在靶向藥品使用過程中，腫瘤為規(guī)避藥品的作用會產(chǎn)生突變，繼而產(chǎn)生耐藥使這類藥品失去效力，如易瑞沙平均耐藥時(shí)間約1年，特羅凱耐藥時(shí)間還要更短些，大概在8個(gè)月左右。耐藥后腫瘤進(jìn)展十分快速，病人不得不重新尋找其它治療辦法。是值得紀(jì)念的一年，《科學(xué)》雜志評論作為最重要的科學(xué)突破的榜首——癌癥的免疫療法。其中以程序性死亡因子1抗體(anti-PD1)及其它免疫檢查點(diǎn)抗體和嵌合抗原受體T細(xì)胞療法（CAR-T療法）最受矚目。PD-1在惡性黑色素瘤和肺鱗癌的治療獲得重大突破，被美國FDA同意用于臨床。CAR-T在B細(xì)胞惡性腫瘤的治療獲得巨大成功，ALL完全緩和率達(dá)成驚人的90%。在此我們著重聊一聊CAR-T免疫療法。CAR-T免疫療法是通過整合嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞來抵抗腫瘤細(xì)胞的療法。嵌合抗原受體能夠特異性識別腫瘤有關(guān)抗原靶點(diǎn)，識別結(jié)合后將激活增殖T細(xì)胞的信號傳遞至胞內(nèi)，引發(fā)T細(xì)胞激活和增殖，從而有效殺傷腫瘤細(xì)胞。自1989年以色列魏茨曼科學(xué)研究所免疫學(xué)家ZeligEshhar將免疫球蛋白scFv與FcεRI受體(γ鏈)或CD3復(fù)合物(ζ鏈)胞內(nèi)構(gòu)造域融合并導(dǎo)入T細(xì)胞制備出第一代CAR-T以來，CAR-T經(jīng)歷了20余年的發(fā)展（圖2）。CAR分子大致可分為5代演變：I代，特異性T細(xì)胞激活；II代，增加共刺激因子，提高細(xì)胞毒性；III代，同時(shí)含有兩個(gè)共刺激因子，提高T細(xì)胞增殖能力與殺傷毒性；IV代，整合自殺基因，精確調(diào)控，細(xì)胞因子釋放（如IL-7，IL-15）激活等；V代，通用型CAR（圖3）。圖2：CAR-T的發(fā)展歷程圖3：CAR分子的演變。I代，特異性T細(xì)胞激活；II代，增加共刺激因子，提高細(xì)胞毒性；III代，同時(shí)含有兩個(gè)共刺激因子，提高T細(xì)胞增殖能力與殺傷毒性；IV代，整合自殺基因，精確調(diào)控，細(xì)胞因子釋放（如IL-7，IL-15）激活等；V代，通用型CAR。CAR-T臨床實(shí)驗(yàn)療效與毒性在血液惡性腫瘤方面，UPenn運(yùn)用CD19-CAR-T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)難治性B-ALL，完全緩和率達(dá)90%；ASCO會議，MSKCC公布一組數(shù)據(jù)，CD19-CAR-T治療B-ALL，32例受試者有29例獲完全緩和，CR率達(dá)91%。在治療實(shí)體瘤方面，運(yùn)用HER2-CAR-T治療HER2+肉瘤患者，共19例患者參加臨床實(shí)驗(yàn)，輸注CAR-T細(xì)胞數(shù)量逐步升高，無明顯CAR-T毒性，部分瘤內(nèi)有少量T細(xì)胞浸潤，4例穩(wěn)定病情達(dá)12周~14個(gè)月，中位生存期10.3月（5.1~29.1個(gè)月）（圖4）；Mesothelin是一種腫瘤有關(guān)抗原，在諸多惡性胸膜間皮瘤中廣泛高體現(xiàn)。以Meso為靶點(diǎn)，通過在T細(xì)胞上瞬時(shí)體現(xiàn)CAR分子，經(jīng)靜脈回輸外加瘤內(nèi)注射的方式對2例入選患者進(jìn)行治療，未出現(xiàn)明顯的副作用，CAR-T細(xì)胞在兩例患者體內(nèi)均體現(xiàn)了一定的抗腫瘤活性，患者腹水中的Mesothelin陽性的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖5）。圖4：HER2-CAR-T治療HER2+肉瘤患臨床療效觀察。部分瘤內(nèi)有少量T細(xì)胞浸潤，4例穩(wěn)定病情達(dá)12周~14個(gè)月，中位生存期10.3月（5.1~29.1個(gè)月）。圖5：以Meso為靶點(diǎn)，通過在T細(xì)胞上瞬時(shí)體現(xiàn)CAR分子，經(jīng)靜脈回輸外加瘤內(nèi)注射的方式對2例入選患者進(jìn)行治療，未出現(xiàn)明顯的副作用，CAR-T細(xì)胞在兩例患者體內(nèi)均體現(xiàn)了一定的抗腫瘤活性，患者腹水中的Mesothelin陽性的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少。接受CAR-T治療的患者會出現(xiàn)毒性反映。如寒戰(zhàn)，發(fā)熱，白細(xì)胞減少，溶瘤綜合癥，巨噬細(xì)胞活化綜合癥，細(xì)胞因子風(fēng)暴，B細(xì)胞缺少及低丙種球蛋白血癥，脫靶效應(yīng)（ontarget/offtumor）等。其中幾乎全部接受CAR-T細(xì)胞治療并且出現(xiàn)應(yīng)答的患者都會出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，這與T細(xì)胞的激活直接有關(guān)，而腫瘤負(fù)荷影響細(xì)胞因子風(fēng)暴的級別（分為1~4級）。通過輸注前化療預(yù)解決，使用輸注細(xì)胞劑量遞增方案，并嚴(yán)密監(jiān)測血清有關(guān)指標(biāo)，如IL-6水平，C-反映蛋白等。運(yùn)用IL-6拮抗劑如Tocilizumab可治療嚴(yán)重細(xì)胞因子風(fēng)暴，并且不會影響CAR-T療效。脫靶效應(yīng)常見于CAR-T治療實(shí)體瘤患者中，由于靶向抗原在正常組織中也低體現(xiàn)，造成CAR-T細(xì)胞攻擊人正常組織，如人肺組織會低體現(xiàn)Her2，Her2-CAR-T細(xì)胞可引發(fā)致命的肺毒性。通過減少scFv親和力，局部瘤內(nèi)注射，尋找腫瘤特異性抗原等辦法來減少或避免這類毒性的發(fā)生。由此可見，現(xiàn)在CAR-T細(xì)胞治療還不夠精確。CAR-T臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與治療方案研究截至10月，全球累計(jì)110項(xiàng)CAR-T臨床實(shí)驗(yàn)在ClinicalT注冊，其中大部分為血液腫瘤的臨床實(shí)驗(yàn)，實(shí)體瘤占38項(xiàng)，均為I/II期臨床實(shí)驗(yàn)（表1），血液腫瘤靶點(diǎn)選擇最多的是CD19,實(shí)體瘤重要靶點(diǎn)選擇是EGFR,GD2,CEA,Her2（圖6）。表1：CAR-T實(shí)體瘤臨床實(shí)驗(yàn)在ClinicalT注冊狀況（截至.10）圖6：實(shí)體瘤靶向抗原選擇比例圖在臨床實(shí)驗(yàn)中，血液腫瘤的CAR-T治療方案為：在獲得臨床實(shí)驗(yàn)同意后，首先根據(jù)入選與排除原則篩選受試者，與受試者訂立知情同意書后對其病情進(jìn)行評定，采集分離PBMC，經(jīng)T細(xì)胞分選，CAR病毒感染，洗脫擴(kuò)增，質(zhì)控檢測后收獲CAR-T細(xì)胞。在細(xì)胞輸注前4天完畢化療預(yù)解決。持續(xù)3天按10%，30%，60%的劑量遞增方式輸注CAR-T細(xì)胞。輸注后六個(gè)月內(nèi)月度隨訪和六個(gè)月后的季度隨訪，以及后的轉(zhuǎn)基因跟蹤。實(shí)體腫瘤的CAR-T治療沒有獲得如血液腫瘤治療后的驚人療效。實(shí)體腫瘤的治療狀況相對復(fù)雜多變。首實(shí)體腫瘤致密構(gòu)造特點(diǎn)妨礙了CAR-T對腫瘤組織的浸潤，造成實(shí)體瘤內(nèi)部沒有足夠的T效應(yīng)T細(xì)胞；再者腫瘤微環(huán)境中存在免疫負(fù)調(diào)節(jié)因素的制約，如免疫克制性細(xì)胞的存在（regulatoryTcells,myeloidderivedsuppressorcells,andM2tumor-associatedmacrophages），克制性細(xì)胞因子（TGF-β,IL-10），腫瘤細(xì)胞表面體現(xiàn)的T細(xì)胞功效克制性蛋白分子(B7-Hfamilymembers,Fasligand)，引導(dǎo)CAR-T向腫瘤灶歸巢的趨化因子等。因此，CAR-T細(xì)胞輸注前患者預(yù)解決方案，如何讓CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)有效增殖并保持高殺瘤活性，如何使CAR-T細(xì)胞有效浸潤在實(shí)體瘤內(nèi)部等一系列問題尚待進(jìn)一步研究。如使用CT模擬定位三維適形放療技術(shù)對實(shí)體瘤進(jìn)行預(yù)解決，或用微創(chuàng)介入或瘤內(nèi)注射的方式，使CAR-T細(xì)胞更多地進(jìn)入到實(shí)體瘤內(nèi)部對靶細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷。另外能夠?qū)AR-T負(fù)載溶瘤病毒以提高對實(shí)體瘤治療的效果（詳見《CAR-T細(xì)胞與溶瘤病毒聯(lián)用》一文）。小結(jié)精確醫(yī)療是將來疾病治療的發(fā)展方向，但是現(xiàn)在腫瘤的精確治療長路漫漫。如果將腫瘤比方為陰，免疫系統(tǒng)比方為陽，則陰陽之間互相對立，互相統(tǒng)一，互相制約，消長與共（圖7）。圖7：腫瘤與免疫治療之間互相對立，互相統(tǒng)一，互相制約，消長與共僅依靠細(xì)胞治療腫瘤還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。手術(shù)，化療，放療能夠快速減少腫瘤負(fù)荷，特異性治療如CAR-T,TCR-T,抗體藥品等能