生物分子達拉的研究進展

生物分子達拉的研究進展

1納米尺度和自動性生物分子達是將化學能轉化為力學能的生物分子。這些大分子廣泛存在于細胞內,它們是蛋白質,也可以是DNA,常處在納米尺度,因此也稱納米機器。生物分子馬達能主動地從環(huán)境中俘獲“能量分子”ATP,借助熱漲落來消耗ATP水解所釋放出的化學能,進而改變自己的構象。一旦與軌道結合,馬達通過構象變換產(chǎn)生與軌道間的相對運動,因此,它們具備“自動性”(motility)。生物分子馬達按材料屬性可分為兩大族,分別是蛋白馬達和DNA馬達。1.1轉動馬達質量標準蛋白馬達按運動形式又可分為線動和轉動兩大類。線動馬達常常與特定軌道結合在一起,利用ATP水解釋放出的化學能產(chǎn)生與軌道的相對運動,其作用機制與人造發(fā)動機類似。這類馬達主要有肌球蛋白(myosin)、驅動蛋白(kinesin)和動力蛋白(dynein)等;轉動馬達則類似于人造電機,也由“轉子”和“定子”兩部分組成。這類馬達包括鞭毛馬達(flagellar)和ATP合成酶(ATPsynthase)等。它們往往是可逆的。其中ATP合成酶既是“電動機”又是“發(fā)電機”。某些蛋白馬達的性質及其與人造機器的比較列于表1。線動馬達又可分為持續(xù)(processive)和非持續(xù)(nonprocessive)馬達。所謂“持續(xù)馬達”是指那些能沿軌道作長距離連續(xù)推進而不脫軌的馬達,其“占空比”(dutyratio)接近100%,在細胞內獨立擔當各種任務。而“非持續(xù)馬達”的“占空比”低于2%,它們往往聚團,以集體形式參與細胞的運動,肌肉收縮即為該現(xiàn)象的體現(xiàn)形式之一。1.2dna分子馬達運轉驅動DNA作為生命遺傳物質,其生化性質和生物學意義已為人們所熟知。然而作為一種納米尺度的材料,DNA以其自身的可編程性、結構的多樣性和變化的可控性等諸多優(yōu)點成為納米科學、生物科學和材料科學交匯點的一顆明星。DNA分子馬達運轉的基礎是DNA不同構象間的可控轉化,這種轉化的控制條件可以是多種多樣的。目前已經(jīng)設計的DNA馬達按控制條件可分為兩大類:一類是環(huán)境刺激響應的馬達,這類分子的構象取決于溶液的環(huán)境條件,如溫度、pH值或某種離子的濃度等,因此,通過變溫或加入酸、堿、鹽等方法改變溶液的環(huán)境條件,即可驅動馬達的運轉;第二類是基于鏈交換反應的馬達,即利用DNA雙鏈互補配對的性質,將特異性的DNA鏈作為燃料來驅動DNA分子的構象變化。2為什么我們要研究生物分子的馬可達馬？2.1生物分子馬達生物分子馬達幾乎參與了所有的生命活動,例如,細胞分裂,“中心法則”的執(zhí)行,生物能量“貨幣”ATP的合成,肌肉收縮,胞漿移動,胞膜穿梭,細胞極化,信號傳導,病毒包裝和細菌的光、化學趨化等。每一個生物過程猶如一個復雜的工廠作業(yè)流程,由各種機器協(xié)同完成。這類機器包括DNA解旋酶、DNA復制酶、mRNA轉錄酶、核糖體和病毒包裝馬達等。其“產(chǎn)品”也多種多樣,例如,信號分子的激活及抑制,大分子的構象變化,某些分子的空間位移等。對于生物分子馬達的研究類似于將整套設備分拆成各個功能不同的部件,就是在單分子水平上認識生物體內的運動規(guī)律。只有認識了各馬達的功能,我們才有可能用系統(tǒng)生物學的方法將各分子的相互作用網(wǎng)絡還原到生命過程,從而進一步揭示生物作用網(wǎng)絡的醫(yī)學和生物學意義。2.2生物分子馬達人造機器要實現(xiàn)化學能與力學能的轉化,必須借助中間介質如熱或電,即能量轉化是間接的,這就決定了人造機器的能量轉化效率是不理想的。生物分子馬達則不同,它們能將化學反應所釋放的化學鍵能通過自身的構象變化直接轉換成力學能。其轉換效率非常驚人,例如驅動蛋白達60%,而ATP合成酶接近100%。因此,在機器的能量轉化效率方面,生物分子馬達給我們帶來很多啟示,這也是為什么它們的力學化學耦合(mechanochemicalcoupling)機制令科學家著迷的原因。2.3種構象的選擇DNA不僅可以構建超分子結構或引導其他分子的富集與組裝,還可以實現(xiàn)納米尺度下的運動。DNA有形成氫鍵的能力,又有著多種構象的選擇,它可以折疊或雜交形成雙鏈、三鏈、四鏈的結構。通過適當?shù)男蛄性O計和條件控制,我們可以操縱DNA的構象變化,即在納米尺度實現(xiàn)可控運動。因此,DNA可以被設計成各式各樣的分子機器,這些機器可以完成分子做功、能量轉換、分子控釋等工作,并有望將各種馬達集合成功能更強大的分子機器或微型工廠,從而在能源、環(huán)保、醫(yī)療乃至更為廣泛的領域實現(xiàn)其神奇的應用。2.4對兩態(tài)熱的計量研究在傳統(tǒng)統(tǒng)計中,一旦我們知道系統(tǒng)的始態(tài)和終態(tài)能量及連接兩態(tài)的路徑,便可確定系統(tǒng)對外作的功。事實上,兩態(tài)的能量及系統(tǒng)與環(huán)境在路徑上的交換熱在玻爾茲曼統(tǒng)計上均有kBT漲落,只是在宏觀統(tǒng)計中,這個量級的漲落被忽略了。如果系統(tǒng)很小,這樣的漲落則不能被忽略。這類微觀系統(tǒng)的統(tǒng)計熱力學問題是納米科學當前所面臨的研究障礙。生物分子馬達正是這樣的微觀系統(tǒng),它為物理學家解決該問題提供了一個理想的研究平臺。3生物分子馬蹄研究的重要進展3.1驅動蛋白和atp的合成蛋白馬達的歷史可以追溯到對肌肉收縮的研究。1846年,Kuhne及其同事首次將肌球蛋白和肌動蛋白細絲(actinfilament)的復合物從肌肉組織中解剖出來;1941年,Straub和Szent-Gyorgyi分別將肌球蛋白和肌動蛋白從復合物中成功分離;1963年,Gibbons識別了驅動精子和纖毛拍動的動力蛋白;1985年,Brady和Vale等純化了沿微管(microtubule)輸運細胞器的驅動蛋白。此后,蛋白馬達的研究步伐有了進一步的加速,尤其是最近二十年,在基因工程的幫助下,科學家們又發(fā)現(xiàn)了大量蛋白馬達。通過馬達域(motordomain)氨基酸序列的比對,大部分蛋白馬達已被歸類到上述三大家族。在ATP合成方面,1929年,Lohmann發(fā)現(xiàn)了ATP;1939—1941年間,Lipmann證明ATP是細胞的能量載體并獲1953年Nobel獎;1948年,Todd用化學方法合成ATP并因此獲得1957年Nobel獎;1940—1950年代,科學家觀察到在細胞呼吸或光合作用期間,線粒體或葉綠體內的ATP濃度會顯著上升;1960年,Racker成功地從線粒體膜上分離出ATP合成酶,該酶由兩部分組成,分別被命名為Fo和F1,從此,該馬達被稱為“FoF1”ATP合成酶。3.2細胞骨架與atp合成隨著X射線衍射及核磁共振(NMR)技術的發(fā)展,科學家相繼獲得了某些主要蛋白馬達的結構,為進一步研究蛋白馬達的功能打下了堅實的基礎。1950年代以來,Huxley專注于肌肉結構的研究,并首次提出了肌肉收縮的細絲滑移模型;1993年和1996年,Rayment和Kull分別解出了肌球蛋白和驅動蛋白的原子結構;細絲和微管的結構也相繼于1990—1998年間由Holmes,Kabsch,Lowe和Nogales等獲得。另一方面,細胞骨架在細胞運動中所扮演的角色也不斷被揭示出來。1989—1997年間,Cortese和Fygenson等證實了單純靠細絲或微管的聚合或解聚也能發(fā)力和產(chǎn)生運動?；谟嘘PATP合成及細胞呼吸之間的關聯(lián)研究,Mitchell于1961年提出了“化學滲透假說”(chemiosmotichypothesis)并獲1978年Nobel獎;1973年,Boyer等首次提出了ATP合成的“結合變換機制”(bindingchangemechanism);1994年,Walker通過晶體結構證實了該機制的正確性,與Boyer分享1997年Nobel獎。1990年以來,一種精巧的質子梯度鉗(ΔpHclamp)技術得到發(fā)展。Graber,Rumberg和Strotmann小組等先后測量了ATP合成酶的整個酶動力學,并發(fā)現(xiàn)ADP和磷酸根Pi的米氏常數(shù)同時隨跨膜質子梯度的上升而下降;2007年,舒咬根等提出了力學化學緊耦合模型,并解析了該馬達的酶動力學。根據(jù)上述實驗結果,該模型排除了ADP和Pi有序結合的可能性,獲得了該可逆馬達的“相圖”(見圖3)。3.3熒光單分子檢測1990年代以前,對細胞內生物大分子的化學性質的研究均通過系綜測量進行,其結果反映的是大量分子的平均行為,而人類對其物理性質的認識僅停留在測序分類和晶體結構之類的靜態(tài)層面上。我們對于生物分子馬達的興趣點是它們的“自動性”,即它們是如何啟動、運動和發(fā)力,以何種方式沿軌道運動,每個運動周期消耗多少燃料,效率如何等,要回答這些問題,必須借助1980年代發(fā)展起來的單分子操縱(manipulation)和實時視見(visualizing)技術,例如原子力顯微鏡(AFM)、光鑷(opticaltweezers)、流場拖曳(hydrodynamicdrag)、磁鉗(magnetictweezers)、玻纖微管(glassmicropiptte)、熒光共振能量轉移(FRET)、及熒光單分子檢測(fluorescencesingle-moleculedetection)等。這些技術既可探測0.1—100nm的位移,又可對單個馬達施加0.1—104pN的外力(見圖4)。1989年,Howard等首次測量了單個驅動蛋白驅動的微管運動;1993—1994年間,Block,Spudich和Yanagida三個小組先后測得驅動蛋白和肌動蛋白的步長和發(fā)力大小;1997年,Block和Gelles兩小組同時測得驅動蛋白每步進8nm消耗一個ATP,證明了驅動蛋白的力學與化學之間是緊耦合的;1999年,Block小組發(fā)展出力鉗(forceclamp)技術,并測量了外力對驅動蛋白酶動力學的影響;2002—2004年間,先后有5個小組(Gelles,Block,Higuchi,Vale和Howard)證實驅動蛋白-1沿微管是步行的(hand-over-hand);1997年,Kinosita小組實時視見了F1在ATP溶液中自發(fā)轉動(也稱“自動”);1998年,他們又發(fā)現(xiàn)這種轉動是“步進”的;2005年,樂加昌小組測量了質子驅動勢作用下Fo產(chǎn)生的扭矩。這些單分子實驗得出了生物分子實時的行為與性質。在分子機器方面,1998年,Block小組測量了單個RNA轉錄酶的發(fā)力和轉錄速率;2000年,Bustamante和Bensimon兩個小組分別用光鑷和磁鑷測量了單鏈DNA張力對復制速率的影響,獲得了相似的結論,即復制速率隨張力的上升而指數(shù)衰減。但在某個張力點,復制速率會出現(xiàn)一個峰值。前者還發(fā)現(xiàn)當張力大于34pN時,T7DNA復制酶會反向外切。2006年,舒咬根等的酶動力學研究顯示,新生鏈的親核攻擊(nucleophilicattack)才是復制酶的限速步驟。3.4dna分子機器1999年,Seeman利用DNA的B—Z異構互變首次組裝出一個離子調控開關,此后,大量的DNA分子機器不斷被設計出來。我們在此介紹兩個有代表性的DNA馬達,即2003年劉東生等利用i-motif結構設計的pH值調控生物分子馬達(圖5),和2004年Yin等人利用三種DNA酶以及DNA設計的定向運動分子機器(圖6)。4發(fā)展的高校學術研究盡管生物分子馬達的研究已經(jīng)持續(xù)了150多年,但突破性進展出現(xiàn)在最近二十年。這些成就既得益于單分子操縱和實時視見技術的發(fā)展,更要歸功于物理學家、生化學家、醫(yī)學家及計算學家等的聯(lián)合交叉研究。隨著單分子技術的不斷提高和理論研究的持續(xù)深入,在可以預見的將來,我們認為下述領域將會有所突破:4.1硫醚的力學性質在馬達單分子實驗中,馬達不斷向環(huán)境耗散能量,本身也處在非平衡態(tài)。在這樣的微觀系統(tǒng)中,馬達始、終態(tài)的能量及其與環(huán)境的交換熱在玻爾茲曼統(tǒng)計上均有kBT(4pN·nm)漲落,這個量級的漲落對于分子馬達的熱力學行為是不能忽略的。因此,如何從單分子實驗的數(shù)據(jù)中“去偽存真”,從而真正揭示分子馬達運動的內在規(guī)律是物理學家面臨的一個非常迫切的問題。4.2非持續(xù)馬達的動力學特性非持續(xù)馬達如myosinII,由于占空比很低,其布朗運動占主導。現(xiàn)有的單分子技術還不能精確測量單個非持續(xù)馬達的步長和發(fā)力大小。非持續(xù)馬達在細胞內是集體行動的,在動力學方面體現(xiàn)出的是集團性質,Julicher和舒咬根等已在理論上研究了集體馬達的運動學和化學動力學,揭示了集體馬達系統(tǒng)的一些獨特性質。如果能在體外重建這樣的系統(tǒng),或直接從肌肉組織中分離肌節(jié),我們就能用單分子技術進行實驗驗證,并進一步深入鈣離子的調控研究。4.3fps的認識有關ATP合成的研究已經(jīng)產(chǎn)生了5位Nobel獎得主,其重要性不言而喻。但我們對ATP合成機制的了解還非常膚淺,其中對F1的理解還停留在唯象層面,對Fo的認識則仍處在卡通階段。如何獲得Fo的結構圖像,F1的3個催化位點之間如何通信,“定子”上的化學循環(huán)與“轉子”的步進式轉動之間如何實現(xiàn)高效的力學化學耦合,是3個位點都要結合核苷才能使F1轉速最大,還是只要2個位點結合就足夠了等問題極具挑戰(zhàn)性。4.4納米質量的重要性盡管DNA馬達在體內尚未被發(fā)現(xiàn),但作為一種易操縱的納米材料,理應對納米科學有所貢獻。如何把握住DNA各方面的優(yōu)勢,利用其性質構建出更精巧、靈敏且高效的分子馬達是當前該領域科研工作的重中之重。4.5kchesin-1和k現(xiàn)行小鏈n-Kinesin-1(圖1)是目前已知的自然界45億年來演化出的最小的分子馬達。它是由2條重鏈組合成的二聚體。Kinesin-1的頭部(也稱馬達域)由氨基酸鏈的N端構成,有2個位點分別與核苷和微管結合;2條重鏈粘合的部分稱為驅干,它與頭部之間的柔性短鏈(13個氨基酸)稱為頸部(necklinker);2個C端和2條輕鏈組成尾巴,負責裝載“貨物”(cargo)。Kinesin-1是持續(xù)馬達,它能沿微管連續(xù)行走數(shù)微米而不脫軌,這就意味著至少有一頭結合在微管上,即兩頭的ATP水解循環(huán)是相互協(xié)調的。盡管Keinsin-1的研究已經(jīng)給我們展示了豐富的結構和生化信息,但我們依然面臨一系列問題。2006年10月在Asilomar召開的第10屆生物物理研討會“MolecularMotors:PointCounterpoint”上提出了以下問題。4.5.1持續(xù)“自動”機制(1)在步行機制中,馬達域之間如何實現(xiàn)通信以協(xié)調各自的ATP水解循環(huán);(2)是否存在有別于步行的持續(xù)“自動”(motility)機制;(3)單頭持續(xù)馬達如何與軌道保持聯(lián)系;(4)雙頭馬達的兩頭是否完全等價;(5)雙頭馬達的非對稱步行機制有哪些功能上的優(yōu)點;(6)馬達如何產(chǎn)生柔性以避開路徑上的障礙;(7)由各種馬達組成的分子機器,如解旋酶、聚合酶和核糖體如何沿軌道移動;4.5.2不同能量的轉化(8)在ATP水解周期中,伴隨發(fā)力和產(chǎn)生運動的是哪個構象變化;(9)催化位點微小的構象變化如何被某些結構(如杠桿)放大到馬達的質心位移;(10)在ATP水解循環(huán)中,各態(tài)如何調節(jié)(某些情況下為遠距離調節(jié))馬達與核苷及軌道間的親和力;(11)軌道如何影響馬達與核苷的親和力及ATP水解速率,又如何平衡各個化學反應態(tài);(12)我們如何才能獲得一個馬達與軌道結合在一起的高分辨結構圖;(13)除了軌道和激活因子外,肌動蛋白和微管還能擔當什么角色;(14)在一個充滿混沌而又漲落著“完美風暴”(perfectstorm)的粘稠的細胞環(huán)境中,馬達如何實現(xiàn)能量的高效轉換;(15)生物分子馬達是否像布朗棘輪那樣從熱漲落獲取能量,熱漲落是否扮演其他角色;(16)蛋白的能量儲存在哪里;(17)怎樣的運動調整機制(kinetictuning)優(yōu)化著馬達在胞內的角色;(18)外力或不同的負載如何影響ATP水解循