胞質(zhì)內(nèi)單精注射技術(shù)的研究進(jìn)展

胞質(zhì)內(nèi)單精注射技術(shù)的研究進(jìn)展

單精細(xì)胞成像（icsi）是指用顯微手術(shù)技術(shù)將單精插入卵細(xì)胞漿中的過程。ICSI是一種新型的體外受精技術(shù),對(duì)于細(xì)胞和分子機(jī)制研究很有意義,其可以調(diào)控注射入卵的成分及量以觀察對(duì)受精的效應(yīng);確定授精時(shí)刻以觀察精卵融合時(shí)間及受精后續(xù)事件發(fā)生時(shí)間;可固定精子進(jìn)入位點(diǎn),控制原核極性和胚胎質(zhì)量,利于研究受精后精核的解聚和原核的發(fā)育能力(陳秋菊等,2003),對(duì)揭示哺乳動(dòng)物雌雄配子間相互作用機(jī)理和受精本質(zhì)具有重要理論意義,對(duì)提高良種公畜的利用率和保護(hù)瀕危動(dòng)物資源及拯救珍稀動(dòng)物具有潛在的實(shí)踐意義(楊增明等,2005)。目前,ICSI已被應(yīng)用于人類的輔助生殖(Van等,2005)、突變系小鼠的種質(zhì)資源保存(Ming等,2005)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)(Ogura等,2005,2003)等方面。在傳統(tǒng)的體外受精(invitrofertilization,IVF)過程中,哺乳動(dòng)物的精子與卵細(xì)胞作用發(fā)生在3個(gè)不同水平:①卵丘顆粒細(xì)胞和透明質(zhì)酸細(xì)胞外基質(zhì)(放射冠);②卵透明帶(zonapellucida,ZP);③卵子質(zhì)膜(張軍等,2005)。ICSI的受精機(jī)制有別于IVF,它避開了IVF過程中這3大屏障的篩選作用,其以單精受精率高、多精受精率低及不受精子濃度、形態(tài)、活力的影響等優(yōu)點(diǎn),在全世界得到廣泛應(yīng)用并受到高度關(guān)注。理論上講ICSI的受精率應(yīng)該為100%,但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其受精率僅為70%左右(Mahutte等,2003),因此有必要了解ICSI技術(shù)的影響因素,以期進(jìn)一步提高ICSI的成功率。1精子因子假說ICSI對(duì)精子幾乎沒有限制,活精子、死精子、射出的不運(yùn)動(dòng)的精子、附睪精子和睪丸精子都可用于ICSI,并可獲得很高的受精率(楊增明等,2005)。精子頭是受精最重要的部分,單獨(dú)精子頭注射可以使卵細(xì)胞活化;精子尾注射卻不能;注射精子核也可活化卵細(xì)胞,但活化率較低(陳秋菊等,2003)。人們據(jù)此提出了精子因子假說,該假說認(rèn)為:精子胞質(zhì)中存在某種或幾種可溶性信號(hào)分子,在精卵質(zhì)膜融合或稍后,該信號(hào)分子通過融合進(jìn)入卵子胞質(zhì)中,從而激活卵子內(nèi)鈣釋放系統(tǒng)而使卵子活化。即精子內(nèi)存在卵細(xì)胞活化因子(sperm-bornoocyte-activatingfactor,SOAF)。另外,ICSI過程中沒有細(xì)胞膜的融合,故精子制動(dòng)很必要,其能破壞精子細(xì)胞膜,使精子細(xì)胞膜腫脹,卵細(xì)胞中的精核去濃縮因子進(jìn)入精細(xì)胞,使精細(xì)胞釋放SOAF,激活卵細(xì)胞(張軼樂等,2005)。而且在制動(dòng)過程中,精子質(zhì)膜受到損傷,能夠提高受精率,這是由于質(zhì)膜完整的活動(dòng)精子注入卵子后,精子在胞質(zhì)內(nèi)運(yùn)動(dòng)一段時(shí)間,會(huì)對(duì)卵子的細(xì)胞器和細(xì)胞骨架造成損傷。2卵母細(xì)胞及其質(zhì)量卵母細(xì)胞成熟后才具有受精能力,卵的成熟包括胞核及胞質(zhì)的成熟。排出第一極體僅是卵母細(xì)胞核成熟的標(biāo)志,極體的不同形態(tài)反映核成熟度的不同。通常超數(shù)排卵能使大量的卵母細(xì)胞快速達(dá)到MⅡ期,但同時(shí)促進(jìn)了第一極體的退化,造成MⅡ期卵的第一極體呈現(xiàn)不同形態(tài),這種卵母細(xì)胞異常受精率較大,其正常受精卵也會(huì)產(chǎn)生低質(zhì)量的胚胎,而且它的紡錘體容易受損,染色體易丟失;第一極體形態(tài)異常也會(huì)導(dǎo)致非整倍體增加,影響胚胎發(fā)育,此種卵細(xì)胞不應(yīng)該用于輔助生殖技術(shù)(彭弋峰等,2004)。卵母細(xì)胞胞漿充分成熟有2個(gè)重要標(biāo)志:①皮質(zhì)顆粒(CGs)向漿膜下遷移并沿質(zhì)膜呈線性排列;②成群線粒體(mt)散開。這是由于前者為精子進(jìn)入胞漿后迅速發(fā)生的皮質(zhì)反應(yīng)和透明帶反應(yīng)創(chuàng)造了良好的條件,后者有利于卵母細(xì)胞充分成熟過程中能量的利用。另外,卵母細(xì)胞的質(zhì)量均以受精率、卵裂率及良好胚胎形成率等方面來評(píng)定。朱亮等(2005)試驗(yàn)結(jié)果顯示,觀測(cè)有紡錘體的卵母細(xì)胞的正常受精率和良好胚胎形成率,均明顯高于無紡錘體的卵母細(xì)胞,但是正常受精的卵母細(xì)胞卵裂率,并不因?yàn)槠涫欠裼屑忓N體而有所不同。3小鼠精子激活試驗(yàn)受精激活主要包括2個(gè)概念:①卵母細(xì)胞的激活,可由精子完成,也可由物理化學(xué)刺激完成;②精子激活,精子進(jìn)入成熟卵母細(xì)胞后,在細(xì)胞質(zhì)中某些因子的作用下,才能完成核去致密和組蛋白替代魚精蛋白的過程(陳秋菊等,2003)。卵母細(xì)胞的激活是以啟動(dòng)并完成第2次減數(shù)分裂、放出第二極體、皮質(zhì)反應(yīng)、雌原核的形成和卵子代謝啟動(dòng)為標(biāo)志;精子激活則以精核去致密、雄原核形成和發(fā)生DNA合成等為標(biāo)志(陳大元,2000)。Rawe等(2000)試驗(yàn)指出:由于卵母細(xì)胞激活失敗導(dǎo)致受精失敗,在ICSI中占39%,而在IVF中僅占15.1%,表明卵母細(xì)胞激活不足是導(dǎo)致ICSI受精失敗的主要原因。由于ICSI越過了自然受精時(shí)精子需要經(jīng)過許多的環(huán)節(jié),如頂體反應(yīng)、精子與透明帶結(jié)合、精卵質(zhì)膜融合等,所以往往不能使卵母細(xì)胞完全激活。因此,ICSI時(shí)必須通過顯微注射針的機(jī)械刺激及注入精子的生物刺激來激活卵母細(xì)胞。在保證卵膜穿破的同時(shí),注射精子前盡量輕柔的重復(fù)多次抽吸胞漿,充分引發(fā)Ca2+釋放以及Ca2+附加峰,達(dá)到激活卵母細(xì)胞的目的。也可通過多種人工處理,如電脈沖激活、與鈣離子載體A23187共孵育等方法,促使卵子激活。舒益民等(2003)將ICSI中41個(gè)受精失敗的人卵母細(xì)胞,在5μmol/L的Ca2+載體A23187中處理5min,觀察第二極體排出及原核形成情況,發(fā)現(xiàn)有30個(gè)發(fā)生激活,其中24個(gè)表現(xiàn)為2PB+2PN,占被激活卵母細(xì)胞總數(shù)的80%,激活后繼續(xù)培養(yǎng)54h,19個(gè)發(fā)生分裂,9個(gè)發(fā)育到2～4細(xì)胞,5個(gè)發(fā)育到4～8細(xì)胞階段,5個(gè)發(fā)育到8細(xì)胞以上階段,表明Ca2+載體A23187能夠有效激活I(lǐng)CSI后受精失敗的卵母細(xì)胞恢復(fù)受精并繼續(xù)發(fā)育成胚胎。4操作技術(shù)4.1微注射針尖的尺寸、操作條件及操作設(shè)備微注射針尖的內(nèi)徑及斜面的角度,對(duì)顯微注射時(shí)卵細(xì)胞損傷程度的大小起著至關(guān)重要的作用。楊益壽等(1998)試驗(yàn)結(jié)果表明,小鼠的ICSI針尖內(nèi)徑在4～5μm、斜面在35°～40°較為合適,此時(shí),整個(gè)精子頭部正位于管口,進(jìn)針容易,且?guī)氩僮饕狠^少,對(duì)卵細(xì)胞機(jī)械損傷小,可獲得較高的受精率。因?yàn)楫?dāng)微注射針尖的內(nèi)徑大于6μm,會(huì)造成卵細(xì)胞較大的損傷,使卵胞質(zhì)較多外流,并使隨精子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的操作液過多,導(dǎo)致卵細(xì)胞溶解。內(nèi)徑小于4μm時(shí),整個(gè)精子頭部完全卡在注射針口外,進(jìn)針時(shí)易使精子頭和尾分離,不能進(jìn)入卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi),給操作帶來一定困難。而且由于小鼠卵細(xì)胞透明帶及卵膜有一定的韌性,斜面大于40°,進(jìn)針時(shí)會(huì)遇到較大的抵抗,難以一次穿透透明帶及卵膜,破壞了細(xì)胞質(zhì)的穩(wěn)定狀態(tài),使受精后的卵細(xì)胞不能正常發(fā)育。對(duì)山羊的ICSI,注射針管的內(nèi)徑以6～8μm為宜(趙曉娥等,2005);在水牛有使用內(nèi)徑8μm(孟凡麗等,2004)針管的報(bào)道。另外,根據(jù)操作設(shè)備的不同,微注射針尖的斜面角度有所不同。如果使用Piezo操作系統(tǒng),拉制過的針在適當(dāng)口徑處斷開后,無需磨針和拔尖即可使用。4.2精子注入的位置和時(shí)間因?yàn)镸Ⅱ期的紡錘體位于卵胞漿外周,與第一極體緊鄰,為了避免損傷卵母細(xì)胞紡錘體,影響受精和胚胎進(jìn)一步發(fā)育,所以第一極體與精子注入的相對(duì)位置在ICSI過程中是一項(xiàng)重要的技術(shù)參數(shù)。傳統(tǒng)的ICSI操作是轉(zhuǎn)動(dòng)卵母細(xì)胞,使第一極體位于6點(diǎn)或12點(diǎn)的位置,然后在3點(diǎn)的位置注入精子。此操作是建立在成熟卵母細(xì)胞紡錘體靠近第一極體假設(shè)的基礎(chǔ)上的,注入精子位置的選擇是為了避免損傷卵母細(xì)胞紡錘體。Garello等(1999)認(rèn)為卵細(xì)胞剛完成第一次減數(shù)分裂逸出第一極體后停滯在MⅡ期,此時(shí)第一極體可能和紡錘體相毗鄰,但隨時(shí)間的推移第一極體便在卵周隙內(nèi)移動(dòng)。Hardarson等(2000)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),第一極體與紡錘體所成的夾角在(26.6±3.3)°～(41.7±4.0)°,約93%卵的紡錘體和第一極體位于卵細(xì)胞的同一半球,所以不能根據(jù)第一極體來準(zhǔn)確預(yù)測(cè)紡錘體的位置。彭弋峰等(2004)認(rèn)為在進(jìn)行ICSI時(shí),應(yīng)盡可能使第一極體遠(yuǎn)離固定針、注射針和精子,將極體置于11點(diǎn)和與之對(duì)稱的7點(diǎn),使紡錘體離精子最遠(yuǎn),可最大限度地減少卵細(xì)胞內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)被破壞。4.3膜穿破方式的影響的關(guān)鍵是能夠成功地穿破卵膜,將被制動(dòng)的單個(gè)精子置于卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)。卵膜的穿破形式取決于操作技術(shù)環(huán)節(jié)和卵母細(xì)胞自身的特性,如卵膜的彈性以及卵母細(xì)胞本身的質(zhì)量都會(huì)影響卵膜的穿破形式。羅海寧等(2002)比較了人卵母細(xì)胞膜穿破方式為顯微注射針直接進(jìn)入胞漿內(nèi)、卵膜穿破、不形成凹痕(A)及顯微注射針進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)、回吸少量胞漿、卵膜在細(xì)胞中部穿破、形成輕微的凹痕(B)2種類型時(shí)的卵母細(xì)胞存活率、卵母細(xì)胞受精率和卵裂胚胎的發(fā)育質(zhì)量,結(jié)果表明卵母細(xì)胞膜穿破方式為A類型時(shí)的卵母細(xì)胞存活率、卵母細(xì)胞受精率、卵裂胚胎發(fā)育質(zhì)量均顯著低于B類型組。這可能是由于A組膜穿破方式的卵母細(xì)胞膜彈性不足,脆性偏高,使得注射針的沖擊力對(duì)卵母細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的破壞性加強(qiáng),故而A組細(xì)胞存活率低,易退化;而B組卵母細(xì)胞膜穿破方式中形成的凹痕可防止卵母細(xì)胞退化,因?yàn)閺椥园己鄣男纬删彌_了胞漿回吸造成的壓力,有助于胞膜完整性的恢復(fù),減少了胞漿和部分細(xì)胞器的破壞和丟失。另外,卵母細(xì)胞膜穿破方式的差異也可能是由膜本身脂蛋白結(jié)構(gòu)上的糖基支鏈等的不同所決定的。4.4精子操作液對(duì)icsi胚發(fā)育的影響聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)經(jīng)自由基聚合而成的一種十分重要的水溶性高分子聚合物,具有良好的溶解性、化學(xué)穩(wěn)定性、成膜性、生理惰性和粘接能力。PVP作為精子操作液中的一種成分,一方面使液體變得粘稠,減緩精子運(yùn)動(dòng)速度,易于將精子吸入和排出,方便ICSI操作;另一方面可以防止膜損傷后的精子粘在管壁上。但是由于PVP本身具有化學(xué)物質(zhì)的一些活性,當(dāng)隨著精子一起注入卵母細(xì)胞質(zhì)后可能會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育造成影響,因此要選擇合適的PVP濃度。許多研究者以前均廣泛采用10%的PVP濃度,后來發(fā)現(xiàn)適當(dāng)降低這一濃度不會(huì)給操作帶來困難。趙曉娥等(2005)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)精子操作液中PVP濃度從10%降低到8%和5%時(shí),ICSI胚的卵裂率差異不顯著,但正常卵裂率、桑椹胚率、囊胚率有所提高,5%和10%的正常卵裂率(69.6%和58.5%)、桑椹胚率(45.6%和35.2%)、囊胚率(26.9%和16.9%)差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明,含5%PV