gdf9基因外顯子2在高繁殖力山羊品種中的多態(tài)性分析

gdf9基因外顯子2在高繁殖力山羊品種中的多態(tài)性分析

綿羊產(chǎn)仔數(shù)是一個非常經(jīng)濟的數(shù)量。對山羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇不僅受到性別的限制,還受到年齡的限制,而且山羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀遺傳力很低,只有0.1左右,因此,難以用常規(guī)的育種技術(shù)來改良產(chǎn)羔數(shù)性狀。標(biāo)記輔助選擇能夠通過影響選擇的時間、選擇的強度以及準(zhǔn)確性而極大地提高這類低遺傳力性狀的選擇功效,而找到與這些數(shù)量性狀基因座相連鎖的分子遺傳標(biāo)記,則是實現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇的先決條件。生長分化因子9(growthdifferentiationfactor9,GDF9)是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一個新成員。Sadighi等將綿羊GDF9基因定位在5號染色體上。GDF9是由卵母細(xì)胞分泌的一種生長分化因子,它對早期卵泡的生長和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用。Dong等將敲除了GDF9外顯子2的雜合子小鼠gdf9mI/+進行雜交,發(fā)現(xiàn)純合子gdf9mI/gdf9mI雄性小鼠能正常繁殖,而雌性小鼠則不育,主要原因是gdf9mI/gdf9mI雌性小鼠的卵泡發(fā)育到初級卵泡就停止而不能繼續(xù)生長分化。Hanrahan等根據(jù)影響綿羊繁殖力基因的命名法則,將GDF9基因編碼區(qū)1184bp處的堿基突變(C→T)命名為FecGH(G8突變),發(fā)現(xiàn)FecGH純合子Cambridge母綿羊和Belclare母綿羊都不育,而雜合子FecGH/FecG+母綿羊比野生型FecG+/FecG+母綿羊排卵數(shù)多,FecGH在Belclare母綿羊和Cambridge母綿羊中的排卵數(shù)效應(yīng)估計值分別為1.79枚±0.548枚(P<0.01)和2.35枚±0.386枚(P<0.01)。在中國地方山羊品種中,濟寧青山羊繁殖力最高,平均產(chǎn)活羔數(shù)為2.94,嶗山奶山羊平均產(chǎn)活羔數(shù)1.80,萊蕪黑山羊平均產(chǎn)活羔數(shù)1.79。本研究以高繁殖力山羊品種(濟寧青山羊)以及低繁殖力山羊品種(嶗山奶山羊,萊蕪黑山羊)為試驗材料,采用單鏈構(gòu)象多態(tài)(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)方法對在繁殖中起重要作用的GDF9基因進行單核苷酸多態(tài)性檢測,以比較GDF9基因在不同山羊品種中的多態(tài)性,并對其SSCP多態(tài)性的DNA片段進行測序比較分析,旨在尋找與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的遺傳標(biāo)記,為山羊高繁殖力的標(biāo)記輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1耳組織樣本濟寧青山羊母羊60只,嶗山奶山羊55只,萊蕪黑山羊32只,耳組織樣采自青島奧特種羊場。以上樣本具有1~3胎的產(chǎn)羔記錄。在耳尖用灑精綿消毒,用耳號鉗剪取耳組織1~2cm,保存于70%酒精中,-20℃凍存。1.1.2ffer、lataq酶、lataq酶基因回復(fù)突變劑DNA提取試劑盒購,普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR相關(guān)試劑MgCl2(25mM)、10×PCRBuffer(Mg2+Free)、dNTPMixture(各2.5mM)、Taq酶(5U/μL)、LATaq酶(5U/μL)、2×GCBufferⅡ(5mMMg2+Plus)、6×LoadingBuffer、DL2000DNAMarker等均購自Takara寶生物工程(大連)有限公司。pMD19-T克隆試劑盒,E.coliCompetentCellsDH5α均購自Takara寶生物工程(大連)有限公司。1.1.3生化生物n,n-甲基Tris、冰乙酸、硼酸、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、甲醛、EDTA、EB(溴化乙錠)染色液、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、APS、TEMED、去離子甲酰胺、溴酚藍(lán)、二甲苯氰FF、蛋白胨、酵母粉、氨芐青霉素鈉、DMF、X-Gal、IPTG等均購自生工生物(上海)股份有限公司;剝離硅烷、親和硅烷等購自北京索萊寶科技有限公司。1.2方法1.2.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank發(fā)表的GDF9基因序列(GenBank登錄號EF446168),用Oligo6.0設(shè)計3對引物,擴增該基因的部分內(nèi)含子、整個外顯子2。引物序列見表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。DNA根據(jù)DNA提取試劑盒提取。1.2.2pcr-sscp分析試驗各擴增片段的PCR反應(yīng)程序是一致的,即94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,退火(退火溫度見表1),30s,72℃延伸1min,30個循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。取5μLPCR產(chǎn)物,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120V,15min)進行檢測,EB染色后在凝膠成像儀上觀察電泳結(jié)果并拍照保存;電泳結(jié)果合格者,方可進行下面的PCR-SSCP分析試驗。PCR擴增體系見表2。1.2.3聚丙烯酰胺凝膠的pcr擴增2.0μLPCR產(chǎn)物和6μL加樣緩沖液(98%甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯氰、10mmol/LEDTA(pH8.0)、10%甘油)混勻,98℃變性10min,然后冰浴10min,使之保持變性狀態(tài)。變性后PCR產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠4℃電泳。上樣完成后,啟動電泳儀,500V高壓壓樣10min。350V,約12h,直至指示劑二甲苯氰FF的條帶距玻璃板下端約2cm時,停止電泳。銀染顯色。引物2、3擴增片段聚丙烯酰胺凝膠交聯(lián)度為29∶1,聚丙烯酰胺凝膠濃度12%。引物1擴增片段聚丙烯酰胺凝膠交聯(lián)度為49∶1,聚丙烯酰胺凝膠濃度8%。1.2.4膠回收試劑盒將SSCP分析后沒有多態(tài)和有多態(tài)的不同基因型純合體的PCR擴增產(chǎn)物用柱式膠回收試劑盒回收純化;回收后的DNA片段用pMD19-T載體連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株,陽性克隆菌液送樣測序,測序反應(yīng)由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。1.2.5引物3的基因型分析配合下列模型進行最小二乘方差分析,比較濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)在GDF9基因型之間的差異(對引物1和引物3的基因型單獨進行分析):其中:yijkl為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值;μ為群體均值;HYSi為第i個場年季的固定效應(yīng);Pj為第j個胎次的固定效應(yīng);Gk為第k種基因型的固定效應(yīng);eijkl為隨機殘差效應(yīng)。用SAS(V8.12)GLM(generallinearmodel)過程完成。2結(jié)果與分析2.1結(jié)果與預(yù)期不符利用設(shè)計的3對引物對GDF9外顯子2目的片段進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其結(jié)果與預(yù)期相符(圖1,圖2,圖3)。對3對引物擴增的PCR產(chǎn)物分別進行SSCP分析,發(fā)現(xiàn)引物2和引物3擴增片段沒有多態(tài)性,引物1擴增片段有3種基因型,分別定義為AA、BB和AB(圖4),引物2擴增片段有多態(tài)性(圖5),引物3擴增片段有3種基因型,分別定義為CC、DD和CD(圖6)。2.2基因型的同義突變?nèi)A和BB兩種基因型的PCR產(chǎn)物片段進行克隆、測序。BB型與AA型相比在外顯子2第26bp處(EF446168的第3319bp處)有1個G→A的單堿基突變。將該突變的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)編碼的第141位氨基酸未改變,仍為亮氨酸,因此為同義突變。取CC和DD兩種基因型的PCR產(chǎn)物片段進行克隆、測序。DD型與CC型相比在外顯子2的第795bp處(EF446168的第4085bp處)有1個G→A的單堿基突變。將該突變的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)第397位氨基酸由纈氨酸改變?yōu)楫惲涟彼?因此為錯義突變。2.3純合基因型個體的篩選3個山羊品種中GDF9基因外顯子2的等位基因頻率和基因型頻率見表3。由表3可見:對于引物1,3個山羊品種都出現(xiàn)AA、AB和BB3種基因型,其中濟寧青山羊、萊蕪黑山羊主要是AA純合基因型個體,A是優(yōu)勢等位基因;嶗山奶山羊B是優(yōu)勢等位基因。對于引物3,3個山羊品種中都出現(xiàn)CC、CD和DD3種基因型,其中濟寧青山羊、萊蕪黑山羊中主要是CC純合基因型個體,C是優(yōu)勢等位基因;嶗山奶山羊大多數(shù)是CD基因型個體,嶗山奶山羊D是優(yōu)勢等位基因。2.4bb基因型不同GDF9基因型的55只濟寧青山羊母羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤見表4。由表4可見:對于引物1,AA基因型濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值比AB基因型的多0.539只(P<0.01),比BB基因型的多0.629只(P<0.01),但對萊蕪黑山羊和嶗山奶山羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)。對于引物3,CC基因型濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值比CD基因型的多0.568只(P<0.01),比DD基因型的多0.62只(P<0.01),CC基因型萊蕪黑山羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值比CD基因型的多0.344只(P<0.01),比DD基因型的多0.379只(P<0.01),但對嶗山奶山羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)。3樣品基因型的變化Hanrahan等在Cambridge和Belclare綿羊GDF9基因發(fā)現(xiàn)了8個突變位點,G2、G3、G5沒有引起氨基酸的改變。G1、G4、G6、G7、G8引起了氨基酸的改變,其中G1、G6、G7的3個改變是相對比較保守的變化。G4在未加工蛋白的241位由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?由一個堿性基團替代了一個酸性基團,但它發(fā)生在弗林蛋白切割之前,不會影響成熟蛋白質(zhì)的活性。G8在395位氨基酸殘基由絲氨酸變?yōu)楸奖彼?在成熟蛋白的第77位由一個非極性基團替代了一個不帶電的極性基團,由于此突變位于成熟蛋白的編碼區(qū),所以導(dǎo)致了GDF9基因功能的改變。本研究設(shè)計3對引物,采用PCR-SSCP技術(shù)檢測GDF9基因外顯子2在3個山羊品種中的單核苷酸多態(tài)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個單核苷酸多態(tài)。外顯子2第26bp處有1個G→A的單堿基突變,但沒有引起氨基酸改變;外顯子2第795bp處有1個G→A的單堿基突變并且導(dǎo)致纈氨酸改變?yōu)楫惲涟彼帷anrahan等報道,當(dāng)GDF9基因野生純合時,Belclare母綿羊排卵數(shù)為1.92枚±0.28枚(n=11),Cambridge母綿羊排卵數(shù)為2.27枚±0.49枚(n=10);當(dāng)GDF9G8突變純合時,Belclare母綿羊和Cambridge母綿羊都不育;當(dāng)GDF9G8突變?yōu)殡s合子時,Belclare綿羊和Cambridge綿羊排卵數(shù)都增加,分別為2.67枚±0.89枚(n=1)和4.28枚±0.31枚(n=28)。Chu等報道在GDF9基因外顯子1中檢測出的AA基因型所對應(yīng)的小尾寒羊第一胎和第二胎產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值分別比AB基因型多0.30只(P<0.05)和0.77只(P<0.01)。吳澤輝等采用PCR-SSCP技術(shù)分析結(jié)果顯示G1189A突變對濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響,其中CC基因型產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值分別比CD基因型和DD基因型多0.57只(P<0.01)和0.62只(P<0.01),產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值在CD基因型和DD基因型之間沒有顯著差異(P>0.05)。本研究結(jié)果初步表明GDF9基因可能與濟寧青山羊高繁殖力有關(guān),也可能于萊蕪黑山羊的多胎性能有關(guān)。由于本研究中樣本數(shù)比較少,值得增加山羊品種數(shù)、擴大樣本數(shù)作深入研究。4氨基酸改變不顯著本研究采用PCR-SSCP技術(shù)發(fā)現(xiàn)GDF9基因外顯子2在3個山羊品種中存在2個單核苷酸多態(tài)。引物2和引物3存在多態(tài)性。對于引物2擴增片段,3個山羊品種均檢測到AA、AB和BB3種基因型,測序分析發(fā)現(xiàn)外顯子2第26bp處有1個G→A的單堿基突變,但沒有引起氨基酸改變;濟寧青山羊A等位基因頻率為0.8917,B等位基因頻率為0.1083;AA基因型濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值比AB基因型的多0.539只(P<0.01),比BB基因