鏈脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的建立

鏈脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的建立

糖尿病被西醫(yī)視為三種困難之一。目前,糖尿病及其并發(fā)癥的病因、發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明,預(yù)防和治療仍不完善,因此建立較理想的動物模型來研究該病的發(fā)病機(jī)制和治療具有重要意義。八十年代以來,國內(nèi)外開始使用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制備糖尿病動物模型,現(xiàn)已用于糖尿病及其并發(fā)癥研究的各個領(lǐng)域。本文對這一模型的制備和胰島形態(tài)學(xué)變化做一系統(tǒng)研究。1材料和方法1.1實驗動物的飼養(yǎng)實驗用封閉群Wistar大鼠60只(華西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),雌雄不限。體重為220～310g。大鼠分成正常對照(CON)、糖尿病1月組(DM1)、3月組(DM3)和6月組(DM6)。每組各15只。實驗動物喂養(yǎng)于該中心的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房,并飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。室內(nèi)通風(fēng)良好,氨濃度小于20ppm,相對濕度為40%～70%。室溫保持在18～22℃。1.2stz法注射尿糖、血糖誘導(dǎo)劑為STZ(德國Boehringer-Manmheim公司產(chǎn)品)。STZ臨用前以0.1mol/L,pH4.2的檸檬酸緩沖液溶解配制成1%STZ溶液,按55mg/kg體重一次性腹腔內(nèi)注射STZ,注射后24h檢測定性尿糖和血糖。尿糖在+++以上,血糖>16.65mmol/L者為成模標(biāo)準(zhǔn)。成模后每周測定一次定性尿糖和體重、24h尿量和飲水量,每月檢測一次血糖(應(yīng)用美國Ames公司Glucometer3微量血糖測定儀和血糖試紙檢測)。1.3he染色取正常與各病程糖尿病大鼠的胰腺,常規(guī)組織脫水、透明,制成石蠟切片,HE染色,光鏡觀察。1.4胰腺組織病理學(xué)染色選擇抗—胰島素(Insulin)抗體,應(yīng)用免疫組化ABC法對已制備的胰腺組織石蠟切片進(jìn)行染色,以檢測胰島β細(xì)胞損害的情況。一抗和ABC檢測藥盒分別為美國Dako和Vector公司產(chǎn)品。染色過程從略。1.5處理數(shù)據(jù)采用方差分析和q檢驗。2結(jié)果2.1成模后24h尿量及飲水量CON大鼠體重呈上升趨勢,飼養(yǎng)6月時平均增加11.24%。而DM各組在病程初始1～3周內(nèi),一度出現(xiàn)不同程度的增加,但隨病程的延長,體重逐漸下降,尤以DM6組明顯,平均下降(23.5±6g。CON組大鼠24h尿量及飲水量分別為(20.4±8.2)ml和(32.7±11.4)ml,而糖尿病大鼠在成模后48h,尿量和飲水量開始增加,1周后,分別為(70.4±20.5)ml和(96.3±26.8)ml。病程3月時則達(dá)到高峰,分別為(152.2±33.4)ml和(186.8±38.5)ml。其后基本穩(wěn)定于這一水平。2.2dm組大鼠的血糖含量CON組及DM各組大鼠在注射STZ前尿糖為陰性,注射48h后尿糖即為+++以上,此后一直維持在+++——++++。CON組大鼠的血糖值為(4.2±0.6)mmol/L,而DM各組在注射STZ后48h血糖值均超過16.65mmol/L,平均為(24.5±5.7)mmol/L。以后血糖值持續(xù)在這一水平。可見DM組大鼠的血糖值明顯高于CON組及注射STZ前,P<0.01。然而,BZ各組間血糖值無顯著性差異,P>0.05。2.3一般狀態(tài)觀察隨著病程的進(jìn)展,糖尿病大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食、搔癢,毛失去光澤、脫毛、消瘦、活動減少,有些大鼠在病程3個月后出現(xiàn)白內(nèi)障。2.4胰島細(xì)胞退行性改變HE染色:顯示正常胰島多為圓形或橢圓形的細(xì)胞團(tuán),分散于胰腺腺泡之間,數(shù)量較多,胰島的界限清,無包膜,細(xì)胞團(tuán)的大小不一,胰島細(xì)胞的胞質(zhì)豐富,核多為圓形(圖1)。注射STZ1、3、6個月后均可見胰島萎縮、數(shù)量減少、分布稀疏、胰島密度減低、胰島細(xì)胞數(shù)亦減少(圖2,3)。高倍鏡下可見胰島細(xì)胞發(fā)生退行性改變,表現(xiàn)為胰島細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)著色淺、空泡增多、細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)分布不均、聚集靠邊、有的細(xì)胞核缺失、只殘留伊紅淺染的細(xì)胞質(zhì),上述改變隨病程的延長而逐漸加重,到病程6月時變化更加嚴(yán)重,胰島數(shù)量極少,尚見胰島間質(zhì)纖維化,纖維細(xì)胞增生(圖4),纖維可向胰島內(nèi)穿插,間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤。免疫組化染色:可見正常大鼠胰島素陽性反應(yīng)細(xì)胞(胰島β細(xì)胞)占胰島細(xì)胞的大多數(shù),多位于胰島中央(圖5),核圓形、胞質(zhì)豐富;注射STZ后1個月,即見胰島β細(xì)胞明顯減少,個別出現(xiàn)細(xì)胞核丟失(圖6)。隨著糖尿病病程的推進(jìn),胰島β細(xì)胞更加減少(圖7,8),到6個月時許多胰島內(nèi)只殘留2～3個β細(xì)胞,有的甚至缺如。3stz分次注射糖尿病模型STZ為一種廣譜抗菌素,具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用,對實驗動物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用。STZ誘導(dǎo)的糖尿病與人類I型糖尿病(IDDM)的臨床表現(xiàn)、經(jīng)過及胰島的改變等方面有許多相似之處。此模型具有制造方法簡便、用藥量小、藥物毒性較低、胰島β細(xì)胞損傷特異性高等優(yōu)點,成為研究I型糖尿病較理想的動物模型。本實驗按55mg/kg體重給大鼠腹腔內(nèi)注射STZ,在注射后48h內(nèi)尿糖出現(xiàn)陽性(+++以上),血糖值亦超過成模標(biāo)準(zhǔn)(16.65mmol/L),以后血糖一直維持在較高的水平,平均為(24.5±5.7)mmol/L。在注射STZ后大鼠逐漸出現(xiàn)飲水、進(jìn)食及尿量增加、消瘦、脫毛、活動減少及白內(nèi)障等表現(xiàn),這些均與以前的報道相符。STZ何以能使大鼠的血糖升高,誘發(fā)動物糖尿病呢?Junod等認(rèn)為是STZ直接破壞胰島β細(xì)胞。我們對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島形態(tài)學(xué)及免疫組化觀察發(fā)現(xiàn),胰島變小、密度減低、胰島數(shù)量減少、分布稀疏、胰島細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)著色淺、細(xì)胞核固縮等退行性改變,胰島β細(xì)胞減少,這些改變隨病程的延長而加重,這與Junod的研究結(jié)果相一致。在病程的急性階段,由于STZ對胰島β細(xì)胞的直接損害,胰島素的分泌減少而致血糖升高,出現(xiàn)糖尿病的各種表現(xiàn)。病程6個月者除有上述改變外,亦出現(xiàn)胰島間質(zhì)纖維化、纖維組織增生、間質(zhì)內(nèi)及胰島內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤、胰島內(nèi)細(xì)胞再生、因此認(rèn)為在糖尿病的慢性階段還可能有免疫機(jī)制的參加。Arison等認(rèn)為STZ首先損傷β細(xì)胞及有關(guān)細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu),引起酶擴(kuò)散和酶活性的改變,進(jìn)而影響β細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)改變。近年來,有學(xué)者針對S