小鼠睪丸生精細(xì)胞中

小鼠睪丸生精細(xì)胞中

總合素是膜表面的一種糖蛋白受體家族分子。至少由16個(gè)亞甲基和8個(gè)亞甲基組成。不同的亞甲基和亞甲基的結(jié)合決定了整合素和配體結(jié)合的性質(zhì)，并分布在各種組織細(xì)胞表面。Shinohara等認(rèn)為β1整合素是小鼠精原干細(xì)胞的表面標(biāo)記物(surfacemarkers)。對(duì)β1整合素在小鼠生后不同發(fā)育階段睪丸中分布的研究,目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道;國(guó)外則多以近交系小鼠為研究對(duì)象,采用免疫熒光結(jié)合功能分析的方法,并且對(duì)出生后各年齡階段的研究不夠具體。Shinohara等人雖然根據(jù)細(xì)胞移植和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,提出β1整合素是小鼠精原干細(xì)胞的表面標(biāo)記物,但是他的這一觀點(diǎn)缺少形態(tài)學(xué)上的支持。因此,本文擬通過(guò)免疫組化SABC法結(jié)合形態(tài)學(xué)分析對(duì)β1整合素在生后不同年齡階段遠(yuǎn)交系昆明小鼠睪丸生精細(xì)胞中的分布情況進(jìn)行研究。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物選取生后1d、4d、7d、10d、11d、2周、3周、4周、5周、6周和成年昆明小鼠(由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,按普通級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng))作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。1.2睪丸的穿刺后切片昆明小鼠用10%水合氯醛按0.3mg/kg體重腹腔注射麻醉。1d、4d昆明小鼠剖開腹腔后取出睪丸組織,直接置于4%多聚甲醛-磷酸緩沖液(PB,0.1mol/L,pH7.4)中固定4～6h。7d、10d、11d、2周、3周、4周、5周、6周和成年昆明小鼠開胸后經(jīng)左心室穿刺,依次灌注生理鹽水(含肝素5000U/L)和4%多聚甲醛-磷酸緩沖液。取出睪丸組織后切成厚1～2mm的組織塊,再置于4%多聚甲醛-磷酸緩沖液中后固定4～6h。固定后的睪丸組織經(jīng)流水沖洗24h后依次經(jīng)過(guò)7.5%,15%,20%和30%蔗糖-磷酸緩沖液(PB,0.1mol/L,pH7.4)脫水,OCT包埋后置-70℃丙酮速凍,然后在恒冷箱冰凍切片機(jī)中切片(厚4μm),裱于用10%多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上。待切片自然風(fēng)干后置于-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.3小鼠抗人1整合素單克隆抗體5%切片自-20℃冰箱取出后自然風(fēng)干,0.01mol/L的PBS(pH7.4)漂洗3次(每次5min)。在室溫下,依次經(jīng)3%過(guò)氧化氫(試劑A)孵育15min,25%雞蛋清(消除內(nèi)源性生物素等的影響)孵育15min,0.05%牛血清白蛋白(BSA,消除醛基等導(dǎo)致的非特異性染色)孵育15min,正常山羊血清工作液(試劑B)封閉10min,小鼠抗人β1整合素單克隆抗體(1∶50,實(shí)驗(yàn)組)或PBS(0.01mol/L,pH7.4,對(duì)照組)孵育過(guò)夜(4℃),生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG(試劑C)孵育15min,辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(試劑D)孵育15min,以上每次孵育后用0.01mol/L的PBS(pH7.4)漂洗3次(每次5min)。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片。小鼠抗人β1整合素單克隆抗體為Chemicon公司產(chǎn)品,由日本福島醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室菅井尚則教授友情贈(zèng)送。試劑A、B、C、D均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。2小鼠睪丸生精小管上皮細(xì)胞的表達(dá)經(jīng)小鼠抗人β1整合素單克隆抗體免疫組化染色后,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸生精小管基膜和管周間質(zhì)細(xì)胞胞膜均呈陽(yáng)性顯色。出生后1d、4d、7d、10d小鼠睪丸生精小管上皮細(xì)胞未見陽(yáng)性顯色反應(yīng);11d、2周、4周小鼠睪丸生精小管上皮細(xì)胞可見陽(yáng)性反應(yīng)集中在增殖能力旺盛的精原細(xì)胞的胞膜上(圖1～4);5周、6周和成年昆明小鼠睪丸生精小管陽(yáng)性反應(yīng)除了表達(dá)于與基膜相接觸的精原細(xì)胞的胞膜(圖5、7、8)外,拉長(zhǎng)期精子細(xì)胞頭部細(xì)胞膜也有較弱的陽(yáng)性表達(dá)(圖6)。以上結(jié)果顯示,生后10d以前小鼠睪丸生精小管上皮細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)β1整合素,從生后11d開始在不同年齡階段小鼠均可見β1整合素在精原細(xì)胞膜的表達(dá)。第5周后的小鼠拉長(zhǎng)期精子細(xì)胞頭部亦表達(dá)β1整合素。3小鼠睪丸中的1整合素as目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于什么是精原干細(xì)胞意見不一。Yoshinaga等報(bào)道,小鼠睪丸中c-kit受體的表達(dá),在A1～A4型精原細(xì)胞為高水平;在In型、B型及早期的前細(xì)線期精母細(xì)胞為低水平;在后期的精母細(xì)胞及精子細(xì)胞中不表達(dá)。Dym和國(guó)內(nèi)學(xué)者張學(xué)明等認(rèn)為,c-kit受體可作為鑒定精原干細(xì)胞的標(biāo)記物。Dym等人把精原細(xì)胞分化型和未分化型,未分化型精原細(xì)胞又依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征分為A0～A45個(gè)亞群。A0型處于貯備態(tài);當(dāng)睪丸遭受損傷后可重新恢復(fù)各級(jí)生精細(xì)胞并維持其正常數(shù)目。A1～A4型為增殖型細(xì)胞,A1產(chǎn)生A2,A2產(chǎn)生A3,A3產(chǎn)生A4。A4不但能分化形成In型和B型精原細(xì)胞,還產(chǎn)生新的A1型精原細(xì)胞,為真正的精原干細(xì)胞。DeRooij等人將未分化精原細(xì)胞劃分為由不同數(shù)目細(xì)胞組成的克隆,即由單細(xì)胞組成的單個(gè)A型(theAsinglespermatogonia,As),2細(xì)胞組成的成對(duì)A型(theApairedspermatogonia,Apr),以及由4,8,16,細(xì)胞組成的鏈狀A(yù)型(theAalignedspermatogonia,Aal)。他們認(rèn)為,在大鼠、小鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠及羊等動(dòng)物,As是真正的精原干細(xì)胞。Shinohara等認(rèn)為在小鼠睪丸細(xì)胞中胞膜含β1整合素的細(xì)胞是精原干細(xì)胞。Shinohara等人主要從功能上和細(xì)胞的生物學(xué)特性上對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行了研究。但他得出的是統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果,其移植的含β1整合素的細(xì)胞中并不能排除精原干細(xì)胞以外的其他睪丸細(xì)胞。并且,用于移植的細(xì)胞來(lái)源于4～6周小鼠,不能代表出生后各個(gè)不同年齡階段的情況,在形態(tài)學(xué)上的證據(jù)也不夠充分。因此,這一結(jié)果沒(méi)有被廣泛接受。本文用免疫組化SABC法結(jié)合形態(tài)學(xué)分析,從生后1d到成年小鼠的各個(gè)不同年齡階段對(duì)Shinohara等人的研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)β1整合素在11d至4周小鼠睪丸生精小管上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)于增殖能力旺盛的精原細(xì)胞的胞膜。而出生后1～10d小鼠睪丸生精小管上皮細(xì)胞未見β1整合素的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,β1整合素是生后11d～4周小鼠睪丸中精原細(xì)胞的表面標(biāo)志。但是,目前尚不能確定β1整合素在生后4周以前是否是鑒定小鼠精原干細(xì)胞的表面標(biāo)志,因?yàn)镾hinohara等人在睪丸細(xì)胞分類移植實(shí)驗(yàn)中用于移植的細(xì)胞主要來(lái)自4～6周小鼠,而不是4周以前小鼠。所以4周以前小鼠睪丸中β1整合素陽(yáng)性細(xì)胞的功能和生物學(xué)特性還有待通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。1994年,Brinster等首次將可育供體雄性小鼠的生殖細(xì)胞注射到不育小鼠的曲細(xì)精管中,結(jié)果受體小鼠產(chǎn)生了具有受精能力的精子并產(chǎn)生了正常后代。該實(shí)驗(yàn)選用的移植細(xì)胞雖然都包括生后10d以前(如生后4d、5d等)的小鼠睪丸細(xì)胞,但這些細(xì)胞可能是精原細(xì)胞的前體細(xì)胞(如原始生殖細(xì)胞),而不是精原細(xì)胞本身。用β1整合素鑒定的4周以前的小鼠精原細(xì)胞胞核被蘇木素深染,有些則正在分裂(圖1、3),顯示4周以前精原細(xì)胞有一個(gè)自我增殖擴(kuò)大精原細(xì)胞總數(shù)的過(guò)程。而5周后由于拉長(zhǎng)期的精子細(xì)胞頭部細(xì)胞膜亦表達(dá)β1整合素(圖6),所以不能認(rèn)為β1整合素是5周后小鼠精原細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志。Fioretta等用自己制備的β1整合素多克隆抗體結(jié)合免疫熒光方法研究β1整合素在大鼠生精上皮中的分布,發(fā)現(xiàn)β1整合素在生后15d大鼠睪丸生上皮中沒(méi)有表達(dá),在生后17d大鼠睪丸的部分生精小管中有表達(dá),在生后20d大鼠睪丸生精上皮中普遍表達(dá)。說(shuō)明β1整合素在生后15～20d大鼠睪丸生精上皮中的表達(dá)有一個(gè)漸進(jìn)的變化。本實(shí)驗(yàn)用β1整合素單克隆抗體結(jié)合免疫組化SABC法研究β1整合素在