生物化學(xué)課件：DNA的復(fù)制和逆轉(zhuǎn)錄2

原核生物DNA復(fù)制過(guò)程TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes1復(fù)制的起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個(gè)問(wèn)題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成2E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列5

3

5

3

（一）

DNA的解鏈3DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

（二）引物合成和引發(fā)體形成含有解螺旋酶、DnaC、B蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。43

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3'HO5'引物酶5引物合成的示意圖67二、DNA鏈的延長(zhǎng)復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

85'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol9領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5

→3

方向可以連續(xù)延長(zhǎng)。10隨從鏈的合成解鏈方向11

在復(fù)制叉同時(shí)合成領(lǐng)頭鏈和隨從鏈bb12復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖1314原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500三、復(fù)制的終止過(guò)程：切除引物，填補(bǔ)空缺，連接切口155

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA連接酶

子鏈中的RNA引物被取代1617岡崎片段形成完整的子鏈的過(guò)程18真核生物DNA生物合成過(guò)程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes19哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。20真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。

復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。一、真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似21增殖細(xì)胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。PCNA為同源三聚體，具有與E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNA夾子，在RFC的作用下PCNA結(jié)合于引物－模板鏈；并且PCNA使polδ獲得持續(xù)合成能力。PCNA水平也是檢驗(yàn)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。22DNA-polδ和polα分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，DNA-polδ通過(guò)PCNA的協(xié)同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由polα催化合成。然后由PCNA協(xié)同，polδ置換polα，繼續(xù)合成DNA子鏈。二、真核生物復(fù)制的延長(zhǎng)發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換23真核DNA聚合酶轉(zhuǎn)換和隨從鏈合成24切除引物的兩種機(jī)制25切除引物的兩種機(jī)制263

5

5

3

領(lǐng)頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體27染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問(wèn)題285

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

29前導(dǎo)鏈產(chǎn)生完整的子染色單體。后隨鏈3

端留下縮短的未復(fù)制的ssDNA區(qū)。30端粒（telomeres）

指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。

末端DNA序列是多次重復(fù)的富含TG堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG……..端粒的功能：

維持染色體的穩(wěn)定性；維持DNA復(fù)制的完整性。

31端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成：3233細(xì)胞分裂一次，由于DNA復(fù)制時(shí)的方向必須從5'方向到3'方向，DNA每次復(fù)制端粒就縮短一點(diǎn)，所以端粒其長(zhǎng)度反映細(xì)胞復(fù)制史及復(fù)制潛能，被稱作細(xì)胞壽命的“有絲分裂鐘”。端粒34NationalCenterforChildHealthandDevelopment(NCCHD),DivisionforAdvancedMedicalSciences研究所外景研究所內(nèi)部動(dòng)物室工作場(chǎng)景端粒酶催化作用的爬行模型36逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays37雙鏈DNA是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。某些病毒的遺傳物質(zhì)是RNA。少數(shù)低等生物里如M13噬菌體，它的感染型只含單鏈DNA。原核生物的質(zhì)粒，真核生物的線粒體DNA，都是染色體外存在的DNA。這些非染色體基因組，采用特殊的方式進(jìn)行復(fù)制。38逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)

逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)

轉(zhuǎn)錄方向相反RNA到DNA，逆轉(zhuǎn)錄是逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下以RNA為模板合成DNA的過(guò)程。

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA以逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制復(fù)制RNADNA39逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA40RNA病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA。這個(gè)DNA保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立繁殖。在某些情況下，這個(gè)DNA通過(guò)基因重組(recombination)，參加到細(xì)胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復(fù)制和表達(dá)。這種重組方式稱為整合(integration)。41分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT3`端羥基

42二、逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。

43三、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制和線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制滾環(huán)復(fù)制

滾環(huán)復(fù)制是某些低等生物的復(fù)制形式，如M13噬菌體等。

在復(fù)制過(guò)程中，DNA的雙環(huán)沿著內(nèi)環(huán)先滾一次，然后沿著外環(huán)再滾一次，內(nèi)外環(huán)是不同時(shí)合成的，但是最終的結(jié)果和親代完全一樣的。44dNTPDNA-polγD環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)是存在于真核的線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制。有固定的起始點(diǎn)，同樣也可以合成引物。三、真核生物線粒體DNA按D環(huán)方式復(fù)制第一個(gè)起始點(diǎn)

第二個(gè)起始點(diǎn)

45在DNA-polγ的催化下，從第一個(gè)起始點(diǎn)沿著內(nèi)環(huán)合成新的子鏈，開環(huán)到一定的程度，在外環(huán)上的第二個(gè)起始點(diǎn)，又開始合成第二個(gè)引物。D環(huán)復(fù)制有時(shí)間差，有獨(dú)立的起始點(diǎn)。D-環(huán)復(fù)制需要合成引物。mtDNA為雙鏈，第一個(gè)引物以內(nèi)環(huán)為模板延伸。至第二個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)時(shí)，又合成另一個(gè)反向引物，以外環(huán)為模板進(jìn)行反向的延伸。最后完成兩個(gè)雙鏈環(huán)狀DNA。復(fù)制中呈字母D形狀而得名。D環(huán)復(fù)制的特點(diǎn)是復(fù)制起始點(diǎn)不在雙鏈DNA同一位點(diǎn)，內(nèi)、外環(huán)復(fù)制有時(shí)序差別。46dNTPDNA-polγ第一個(gè)起始點(diǎn)

第二個(gè)起始點(diǎn)

DNA損傷與修復(fù)

DNADamageandRepair47DNA的突變具體指?jìng)€(gè)別dNTP殘基以至片段DNA在構(gòu)成，復(fù)制或表型功能的異常變化，也稱為DNA的損傷。從分子水平來(lái)看，突變就是DNA分子上堿基的改變。48突變?cè)谏锝缙毡榇嬖冢ㄒ唬┩蛔兪沁M(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)從長(zhǎng)遠(yuǎn)的生物史看，進(jìn)化過(guò)程是突變的不斷發(fā)生所造成的。大量的突變都是屬于這種類型，只是目前還沒(méi)能認(rèn)識(shí)其發(fā)生的真正原因，因而名為自發(fā)突變或自然突變。49突變?cè)谏锝缙毡榇嬖冢ǘ┲挥谢蛐透淖兊耐蛔冃纬蒁NA的多態(tài)性這種突變沒(méi)有可察覺(jué)的表型改變?；蚨鄳B(tài)性－詞用來(lái)描述個(gè)體之間的基因表型差別現(xiàn)象。如：親子鑒定

很多預(yù)防醫(yī)學(xué)相關(guān)的一些疾病敏感度，不同的疾病的敏感性也可以通過(guò)基因的多態(tài)性方面研究來(lái)得到相應(yīng)的結(jié)果。50（三）致死性突變可導(dǎo)致個(gè)體，細(xì)胞的死亡（四）突變導(dǎo)致某些疾病

現(xiàn)在廣泛存在的，一個(gè)突變?cè)斐赡承┘膊∪缒[瘤等，這些與環(huán)境污染有關(guān)。環(huán)境污染然主要通過(guò)基因突變引起正?；虻谋磉_(dá)出現(xiàn)障礙。51多種化學(xué)和物理因素可誘發(fā)突變大量的突變屬于自發(fā)突變，發(fā)生頻率只不過(guò)10-9左右，但生物的基因組龐大，細(xì)胞繁殖速度快，因此長(zhǎng)期積累，引發(fā)某種特定的表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)室用的誘發(fā)突變因子，也是導(dǎo)致突變的因素，主要有物理因素和化學(xué)因素。52物理因素：主要是輻射，紫外線，各種輻射，這些輻射對(duì)基因引發(fā)一定的傷害。53化學(xué)因素：化學(xué)因素都可以誘發(fā)基因的變化，某一點(diǎn)的配對(duì)都可以改變。54引發(fā)突變的分子改變有多種錯(cuò)配－點(diǎn)突變：核苷酸的堿基某一點(diǎn)改變?nèi)笔В篋NA的一個(gè)堿基或一段核苷酸丟失插入：DNA的一個(gè)堿基或一段核苷酸插入重排：核苷酸片段與核苷酸片段之間排列發(fā)生改變

無(wú)論是插入或缺失都會(huì)引發(fā)一個(gè)非常嚴(yán)重的后果－框移突變?？蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生了改變。5556框移突變無(wú)論是插入或缺失都會(huì)引發(fā)一個(gè)非常嚴(yán)重的后果－框移突變。DNA損傷（突變）可能造成兩種結(jié)果：其一是導(dǎo)致復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的障礙；其二是復(fù)制后基因突變，使DNA序列發(fā)生永久性改變。所以，必須通過(guò)進(jìn)化使細(xì)胞擁有機(jī)靈的機(jī)制，以識(shí)別和修復(fù)這些損傷，否則細(xì)胞無(wú)法維持正常代謝。57DNA損傷的修復(fù)有多種類型修復(fù)是對(duì)已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。修復(fù)的主要類型：錯(cuò)配修復(fù)－通過(guò)DNA聚合酶的校讀功能對(duì)錯(cuò)配的核苷酸立即水解掉直接修復(fù)（光復(fù)修復(fù)）切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)58一、有些DNA損傷可以直接修復(fù)

嘧啶二聚體的直接修復(fù)59核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcisionrepair）

①首先，由一個(gè)酶系統(tǒng)識(shí)別DNA損傷部位；②其次，在損傷兩側(cè)切開DNA鏈，去除兩個(gè)切口之間的一段受損的寡核苷酸；③再次，在DNA聚合酶作用下，以另一條鏈為模板，合成一段新的DNA，填補(bǔ)缺損區(qū)；④最后由連接酶連接，完成損傷修復(fù)。這是細(xì)胞內(nèi)最重要和最有效的修復(fù)方式60①核苷酸切除修復(fù)不僅能夠修復(fù)整個(gè)基因組中的損傷，而且能拯救因轉(zhuǎn)錄模板鏈損傷而暫停轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，即參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)。②

轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)意義在于，將修復(fù)酶集中于正在轉(zhuǎn)錄的DNA，使該區(qū)域的損傷盡快得以修復(fù)。61E.coli的NER主要由4種蛋白質(zhì)組成：UvrAUvrBUvrC

62（三）重組修復(fù)

63①受損傷的DNA鏈復(fù)制時(shí)，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。②完整的另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補(bǔ)子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口。③以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)。重