大連近岸海域經(jīng)濟(jì)貝類麻痹性貝毒的檢測(cè)與分析

大連近岸海域經(jīng)濟(jì)貝類麻痹性貝毒的檢測(cè)與分析

大連是美國(guó)和山東的主要養(yǎng)雞場(chǎng)。隨著氣候變暖及赤潮的頻繁發(fā)生,大連地區(qū)出現(xiàn)貝毒危害,并且已經(jīng)影響到本地區(qū)的貝類食用安全和貝類出口。因此加強(qiáng)大連近岸海域毒素的含量監(jiān)測(cè)對(duì)于海產(chǎn)貝類的食用安全極為重要。對(duì)我國(guó)南方海域貝毒分布狀況研究已有報(bào)道,如吳施衛(wèi)等對(duì)廣東沿海麻痹性貝毒的地理分布特征進(jìn)行了研究,并對(duì)2003年的海南近岸海域的貝類中麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)進(jìn)行了小白鼠檢測(cè)分析。胡顥琰等采用小白鼠生物檢測(cè)法和HPLC法對(duì)浙江舟山海域和浙江中南部海域的PSP進(jìn)行了調(diào)查分析。目前對(duì)我國(guó)北方海域貝毒分布狀況研究相對(duì)較少。隨著沿海近岸水體污染日益嚴(yán)重,有必要對(duì)大連近岸海域的貝毒分布狀況進(jìn)行研究。研究不同器官中可溶性毒素結(jié)合蛋白對(duì)于闡明貝毒的積累機(jī)理尤為重要。PSP主要是由于貝類通過濾食或攝食能產(chǎn)生PSP的有毒藻類而積累的,其各組織積累PSP的能力存在明顯的組織間差異。目前,針對(duì)蝦夷扇貝中貝毒結(jié)合蛋白的研究沒有報(bào)道。本文針對(duì)大連近岸海域的情況,研究了貝毒分布和蝦夷扇貝不同組織中的蛋白質(zhì)對(duì)麻痹性貝毒的結(jié)合能力,為貝毒的監(jiān)測(cè)和和深入研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1樣品采集和采集樣品于2007年1月至2008年10月間在大連地區(qū)的長(zhǎng)海、莊河、瓦房店和旅順近岸海域進(jìn)行了樣品采集,所采樣品均為當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖和食用貝類。同時(shí),在大連市的黑石礁和長(zhǎng)興水產(chǎn)市場(chǎng)采集了樣品。樣品采集后,立即在現(xiàn)場(chǎng)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。用干凈的海水洗去樣品外殼,用解剖刀將樣品組織與貝殼分開,再將消化腺與其他組織分開,各部分稱量后置入保鮮食品袋內(nèi),于-20冷凍保存。1.2小鼠單位毒素提取參照出口貝類麻痹性毒素檢驗(yàn)方法SN0352-95和AOAC檢測(cè)方法對(duì)PSP毒素用鼠單位予以定量。鼠單位定義:對(duì)體重為20g的小白鼠腹腔注射1mL貝肉提取液,在15min時(shí)殺死小鼠所需的最低毒素量為1鼠單位。采用Saxitoxin(PSP)毒素作為毒素的標(biāo)準(zhǔn)品,將鼠單位換算成毒素的微克數(shù)。根據(jù)小鼠注射貝類提取液后的死亡時(shí)間,并按小鼠體重,校正鼠單位,計(jì)算每100g貝肉內(nèi)的麻痹性毒素的微克數(shù)。測(cè)定結(jié)果代表存在于貝肉內(nèi)各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的麻痹性毒素的總量。1.3酶標(biāo)板的制備分別取100μLPBS、100μL樣品加入100μL碳酸鹽緩沖液置于96孔酶標(biāo)板中,于4冰箱中孵育12h。把酶標(biāo)板中的溶液倒掉,用PBS緩沖液洗3次(100μL/孔)。加入0.1%的BSA-PBS緩沖溶液(100μL/孔),將該板置于37的保溫箱中恒溫2h。取出酶標(biāo)板,把酶標(biāo)板中的溶液倒掉,用PBS緩沖液洗3次。每孔加入50μL酶聯(lián)麻痹性貝毒,混勻,室溫下避光放置15min。每孔加入100μL終止液,混勻,15min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450。1.4資金積累的檢測(cè)取蛋白質(zhì)粗提液加于DE52纖維素離子交換層析柱上,以含有0～1mol/LNaCl的0.05mol/LpH7.4PB進(jìn)行梯度洗脫,然后用紫外分光光度計(jì)在280nm處測(cè)每試管洗脫液的吸光值,收集有吸收峰的洗脫液,采用Saxitoxin(PSP)ELISA試劑盒,測(cè)定貝毒結(jié)合蛋白結(jié)合麻痹性貝毒的能力,將具有貝毒結(jié)合能力的洗脫液合并,透析凍干。對(duì)DE52纖維素離子交換層析所得的有貝毒結(jié)合能力的組分進(jìn)行SephadexG-100分子篩層析。層析柱2×100cm,以0.05mol/LpH7.4PB為洗脫液。用紫外分光光度計(jì)在280nm處測(cè)每試管洗脫液的吸光值,收集有吸收峰的洗脫液,采用ELISA方法測(cè)定有吸收峰的洗脫液的貝毒結(jié)合能力,將具有貝毒結(jié)合能力的洗脫液合并,透析凍干。1.5聚丙烯酰胺的合成根據(jù)Laemmli的方法,用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定貝毒結(jié)合蛋白。用15%聚丙烯酰胺作為分離膠,4%聚丙烯酰胺作為濃縮膠。分子量的測(cè)定是通過如下標(biāo)準(zhǔn)蛋白:磷酸化酶B(97.4kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵清蛋白(42.7kDa)、碳酸酐酶(31kDa)、胰蛋白酶抑制劑(20.14kDa)和α-乳清蛋白(14.4kDa)。2結(jié)果與討論2.1pcr檢測(cè)能力大連近岸海域PSP的檢測(cè)結(jié)果列于表1。從表1可以看出2007年4月、5月、6月、7月和9月以及2008年4月、5月、7月和8月在長(zhǎng)海哈仙島、長(zhǎng)海獐子島、長(zhǎng)海廣鹿島、長(zhǎng)海財(cái)神島及莊河黑島的扇貝和蝦夷扇貝中檢測(cè)的PSP超標(biāo)。2008年4月長(zhǎng)海財(cái)神島的蝦夷扇貝PSP為1512Mu/100g軟組織,超標(biāo)3.78倍,2008年5月莊河黑島的扇貝PSP為1134Mu/100g軟組織,超標(biāo)2.84倍。同時(shí),2008年2月、4月瓦房店交流島的魁蚶中PSP超標(biāo)。2008年3月長(zhǎng)海財(cái)神島的紫石房蛤中以及2008年5月、6月長(zhǎng)海獐子島的紫石房蛤中PSP含量均超標(biāo)。在雜色蛤和牡蠣中未檢出PSP。從發(fā)生的時(shí)間上來看,2007年4月至9月及2008年2月至8月貝類中的PSP超標(biāo)情況較多。對(duì)大連地區(qū)近岸海域麻痹性貝毒分布情況的調(diào)查,目前開展較少。本論文進(jìn)行的研究工作,由于時(shí)間較短,其結(jié)果可能帶有一定的偶然性,但一定程度上反映了目前大連地區(qū)近岸海域麻痹性貝毒分布情況的一些基本特征。大連長(zhǎng)海縣海域是重要的海水養(yǎng)殖區(qū),由于養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)水體交換速度慢,分布集中,養(yǎng)殖密度過大,大量生物代謝物無法及時(shí)為底棲生物及微生物消耗和分解,從而造成沉積。長(zhǎng)期的高密度養(yǎng)殖使海域極度富營(yíng)養(yǎng)化,在此情況下,極易引發(fā)藻類的繁殖。因此,大連地區(qū)近岸海域麻痹性貝毒含量的高低與海域的富營(yíng)養(yǎng)化密切相關(guān)。2.2蝦夷貝毒結(jié)合細(xì)胞的分離和純化選取經(jīng)小白鼠生物檢測(cè)法未檢出PSP的蝦夷扇貝,分別取貝肉、消化腺及裙邊的蛋白質(zhì)為樣品,每種樣品進(jìn)行梯度稀釋,用ELISA法測(cè)其結(jié)合PSP的能力。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450數(shù)據(jù)如表2所示。由表2可知:蝦夷扇貝貝肉、消化腺、裙邊中均能與PSP結(jié)合,且具有濃度依賴性,其中貝肉中蛋白質(zhì)結(jié)合PSP的能力最強(qiáng),因此選用貝肉蛋白質(zhì)為樣品進(jìn)行分離貝毒結(jié)合蛋白。將蝦夷扇貝貝肉中蛋白質(zhì)的粗提液經(jīng)DEAE-52柱層析,測(cè)定OD280,結(jié)果如圖1所示,洗脫過程中收集到3個(gè)明顯的峰。分別合并17-36管、38-49管、51-83管,透析、冷凍干燥以備用。并取第26管、41管、62管、67管作為樣品,用ELISA法測(cè)定其結(jié)合PSP的能力。第67管中蛋白質(zhì)與PSP結(jié)合的量最多,合并57-76管層析組分繼續(xù)分離。經(jīng)SephadexG-100柱層析,測(cè)定結(jié)果如圖2。ELISA檢測(cè)表明,第46管中蛋白質(zhì)與PSP結(jié)合的量最多。合并第43-47管,凍干經(jīng)SDS檢測(cè),初步分離的蝦夷扇貝麻痹性貝毒結(jié)合蛋白的分子量為113kDa和72.4kDa(圖3)。3蝦夷小貝中的4種貝毒結(jié)合能力的比較大連地區(qū)近岸海域經(jīng)濟(jì)貝類麻痹性貝毒從發(fā)生的時(shí)間上來看,2