第8章-熒光免疫技術(shù)

第八章熒光免疫技術(shù)第一節(jié)概述一、熒光的基本知識(shí)二、熒光物質(zhì)第二節(jié)熒光抗體技術(shù)一、熒光抗體的制備二、標(biāo)本的制作三、熒光抗體染色與結(jié)果判斷四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第三節(jié)熒光免疫分析的類型一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定二、熒光偏振免疫測(cè)定三、熒光酶免疫測(cè)定第四節(jié)熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用二、熒光免疫測(cè)定的應(yīng)用思考題小結(jié)

第一節(jié)概述

熒光（fluorescence）熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，以波長(zhǎng)大于激發(fā)光波長(zhǎng)的發(fā)射光形式釋放出能量，此發(fā)射光稱為熒光。

一、熒光的基本知識(shí)發(fā)射光譜和激發(fā)光譜

發(fā)射光譜：是指固定激發(fā)波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下記錄的樣品發(fā)射熒光的強(qiáng)度，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光波長(zhǎng)譜。激發(fā)光譜：是指固定檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)樣品記錄的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度，即能激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)譜。

熒光的基本知識(shí)熒光效率定義:熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率計(jì)算公式:

熒光效率=

選擇激發(fā)光波長(zhǎng)在最接近于熒光物質(zhì)的最大吸收峰處，而測(cè)定熒光波長(zhǎng)設(shè)在接近于最大發(fā)射光波峰時(shí)，可得到最高的熒光效率。熒光的基本知識(shí)熒光壽命定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。激發(fā)光消失，熒光現(xiàn)象隨之消失，但各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。

熒光的基本知識(shí)熒光淬滅

定義:熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。（如紫外線照射、高溫（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等）熒光淬滅是由于激發(fā)態(tài)電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。熒光的基本知識(shí)熒光偏振

FH－FLP＝──────

FH＋FL熒光的基本知識(shí)P：偏振度FH：激發(fā)光起偏器和熒光檢偏器的透射軸方向平行時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度FL：上述兩者方向互相垂直時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度當(dāng)P=0時(shí)，說明完全不偏振；當(dāng)P在-1至1之間，即為部分偏振熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)（應(yīng)用最廣泛）490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測(cè)定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT(淬滅速度慢)藻紅蛋白（PE）565nm578nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)，可與FITC共用488nm激發(fā)光7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATEu3+螯合物340nm613nm時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定熒光物質(zhì)：是一類能吸收激發(fā)光的光能而發(fā)射熒光的物質(zhì)。

常用的熒光物質(zhì)二、熒光物質(zhì)此外，還有熒光底物，如4-甲基傘酮磷酸鹽、4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷、對(duì)羥基苯乙酸。

第二節(jié)

熒光抗體技術(shù)

（FluoresenceAntibodyTechnique,FAT）

熒光抗體技術(shù)的基本原理

熒光素標(biāo)記抗體與切片中組織/細(xì)胞抗原反應(yīng)，洗滌分離后熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物及其部位，對(duì)組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位檢測(cè)，或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測(cè)定。熒光抗體技術(shù)的內(nèi)容

熒光抗體制備標(biāo)本制作熒光抗體染色熒光顯微鏡檢查抗體要求

高特異性高親和力經(jīng)純化提取IgG

(抗血清)一、熒光抗體的制備有能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。熒光素要求熒光抗體的制備抗體的熒光素標(biāo)記標(biāo)記原理:利用抗體蛋白的自由氨基與FITC的異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。標(biāo)記方法:

攪拌法：適于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標(biāo)記時(shí)間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。

透析法：適于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體。將裝有待標(biāo)記蛋白的透析袋放入含熒光素的buffer中。標(biāo)記比較勻，非特異染色較低。熒光抗體的制備去除游離熒光素：透析或凝膠過濾（如G50，第1峰為結(jié)合峰，第2峰為熒光素峰）去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交換層析法（未結(jié)合熒光素的抗體熒光標(biāo)記合適的抗體過量結(jié)合的抗體（陰離子較多），收集中間段）去除非特異反應(yīng)抗體：動(dòng)物肝粉吸收(最好是與試驗(yàn)標(biāo)本同種的動(dòng)物臟器)熒光抗體的純化熒光抗體的制備熒光素與蛋白結(jié)合比率：熒光素（F）結(jié)合到蛋白（P）上的量。

F/P=FITC標(biāo)記的熒光抗體稀釋至A280nm

≈

1.0，分別測(cè)定A280nm（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和A495nm（標(biāo)記熒光素FITC的特異吸收峰），F(xiàn)/P比值要適宜：組織切片用熒光抗體F/P=1.5，活細(xì)胞染色F/P=2.4為宜?？贵w效價(jià)：雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)抗體特異性：吸收試驗(yàn)（加入過量抗原后，應(yīng)不與陽性標(biāo)本反應(yīng)）、抑制試驗(yàn)（陽性標(biāo)本與未標(biāo)抗體預(yù)結(jié)合后，應(yīng)不與熒光抗體結(jié)合）熒光抗體抗體特異性染色滴度：倍比稀釋熒光抗體的鑒定熒光抗體的制備-20℃：保存1～2年真空干燥：長(zhǎng)期保存熒光抗體的保存熒光抗體的制備組織切片：冷凍切片、石蠟切片印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織

涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液培養(yǎng)細(xì)胞：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本的類型二、標(biāo)本的制作冷凍切片：操作簡(jiǎn)單，抗原損失少，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰。

石蠟切片：組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)清楚，抗原損失多（抗原修復(fù)）。組織切片的類型標(biāo)本的制作固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃標(biāo)本的固定和保存標(biāo)本的制作直接法直接熒光抗體染色法示意圖熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。特異性好敏感性較間接法差一種熒光抗體只能檢測(cè)一種抗原三、熒光抗體染色及結(jié)果判斷間接法特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

特異性較直接法差敏感性高5-10倍一種熒光抗體只能檢測(cè)多種抗原間接熒光抗體染色法示意圖熒光抗體染色及結(jié)果判斷雙標(biāo)記法兩種熒光素分別標(biāo)記兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。反應(yīng)原理同直接法。該法用于檢測(cè)同一標(biāo)本內(nèi)的兩種抗原。（流式）熒光抗體染色及結(jié)果判斷

設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照:陽性對(duì)照和陰性對(duì)照

區(qū)分特異和非特異染色

陽性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型，陽性細(xì)胞的顯色深淺可作為抗原定性、定位和定量的依據(jù)。熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷

“-”：無或僅見極微弱熒光。

“+”：熒光較弱但清楚可見?！?+”：熒光明亮?！?++”：耀眼強(qiáng)熒光。特異熒光強(qiáng)度“++”以上判定為陽性，陰性對(duì)照應(yīng)呈“-”或“±”。根據(jù)呈"++"的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價(jià)。

熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷熒光顯微鏡

利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。

四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)?/p>

濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭、復(fù)色差鏡頭、氟處理鏡頭熒光顯微鏡熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱，位于燈室的聚光鏡前面。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過紫外線可見波長(zhǎng)的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護(hù)眼睛。熒光顯微鏡濾光片熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)熒光顯微鏡光路熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源、光路、激發(fā)濾光片、聚光鏡等適宜組合，才能在黑色背景上獲得滿意的熒光。

第三節(jié)

熒光免疫分析的類型

熒光免疫分析的基本原理將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對(duì)液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。熒光抗體技術(shù)熒光免疫測(cè)定均相熒光免疫測(cè)定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相熒光免疫測(cè)定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)。熒光免疫技術(shù)的類型熒光免疫測(cè)定的方法類型

非均相熒光免疫測(cè)定：

時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定、熒光酶免疫測(cè)定均相熒光免疫測(cè)定：

熒光偏振免疫測(cè)定自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長(zhǎng):10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系元素特異熒光（可有效降低本底熒光的干擾）。基本原理時(shí)間分辨檢測(cè)原理示意圖時(shí)間分辨一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定stokes位移:激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長(zhǎng)差。

Stokes位移小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑭系元素Stokes位移大(273nm)，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜不重疊。stokes位移基本原理時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定發(fā)射光譜帶較窄：613nm±10nm，干擾少。光柵激發(fā)光譜帶較寬：300nm～350nm，有利于增加激發(fā)能，提高靈敏度?；驹戆l(fā)射光譜和激發(fā)光譜時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定比活性：?jiǎn)挝粫r(shí)間每個(gè)標(biāo)記分子被探測(cè)的信號(hào)量熒光激發(fā)光源：脈沖氙燈，1000次/S激發(fā)，比活性提高。（在測(cè)量時(shí)間內(nèi)，Eu3+（銪）標(biāo)記物可被反復(fù)激發(fā)，每次激發(fā)后，它由激發(fā)態(tài)很快回到基態(tài)，就有熒光發(fā)出，然后又可被重新激發(fā)）基本原理熒光標(biāo)記物的相對(duì)比活性時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定結(jié)合β-二酮體Eu3+解離酸性增強(qiáng)液熒光增強(qiáng)Eu3+標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物基本原理信號(hào)增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定

鑭系元素銪(Eu3+)（最常用）釤(Sm3+)鋱(Tb3+)（te）釹(Nd3+)鏑(Dy3+)標(biāo)記物熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000細(xì)胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA1000羅丹明B3.0常見熒光物質(zhì)的熒光壽命時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定鑭系元素離子在游離狀態(tài)下，熒光信號(hào)很弱，只有與適當(dāng)螯合劑形成螯合物后，可使熒光得到增強(qiáng)，而螯合物的熒光壽命與形成螯合物的配位體有關(guān)。NTA:萘甲酰三氟丙酮;PTA：三甲基乙酰三氟丙酮標(biāo)記方法

雙功能螯合劑：1-（對(duì)-苯偶氮）-EDTA異硫氰酸苯基-EDTA異硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸（DTPA）標(biāo)記方法：一步法：先螯合Eu3+，再連接蛋白質(zhì)二步法：先連接蛋白質(zhì)，再螯合Eu3+時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定鑭系元素離子-螯合劑-抗原（抗體）復(fù)合物方法類型

雙抗體夾心法固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定方法類型時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（雙抗體夾心法）示意圖雙抗體夾心法固相抗體和Eu3+標(biāo)記抗體與待檢抗原結(jié)合，形成固相抗體-待檢抗原-Eu3+標(biāo)記抗體復(fù)合物，酸性增強(qiáng)液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定方法類型固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法待檢抗原和Eu3+標(biāo)記抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定方法類型固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個(gè)數(shù)量級(jí)標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長(zhǎng)測(cè)量快速，易自動(dòng)化無放射性污染易受污染，本底增高方法評(píng)價(jià)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定光線通過偏振濾光片后，形成一個(gè)方向的平面光稱為偏振光。偏振熒光(綠光,525nm～550nm)偏振光(藍(lán)光,485nm)熒光物質(zhì)基本原理二、熒光偏振免疫測(cè)定偏振熒光有很強(qiáng)的方向性一個(gè)方向一個(gè)方向熒光偏振免疫測(cè)定（FPIA）是利用抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，根據(jù)熒光素（常用FITC）標(biāo)記抗原與其抗原-抗體復(fù)合物之間熒光偏振強(qiáng)度的差異，測(cè)定體液中小分子物質(zhì)的含量。

抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)AgF分子小，轉(zhuǎn)動(dòng)速度快，偏振熒光弱AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動(dòng)速度慢，偏振熒光強(qiáng)若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比熒光偏振免疫測(cè)定原理示意圖基本原理熒光偏振免疫測(cè)定方法評(píng)價(jià)

樣品用量少熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)重復(fù)性好快速，易自動(dòng)化適于小、中等分子物質(zhì)檢測(cè)靈敏度較非均相熒光免疫測(cè)定法低熒光偏振免疫測(cè)定基本原理熒光酶免疫測(cè)定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖

堿性磷酸酶標(biāo)記抗體或抗原，固相載體包被抗原或抗體，酶分解4-MUP，脫磷酸根基團(tuán)形成4-MU，360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm熒光。三、熒光酶免疫測(cè)定酶和熒光底物熒光酶免疫測(cè)定標(biāo)記用酶及熒光底物

標(biāo)記酶底物熒光產(chǎn)物激發(fā)光(nm)熒光(nm)相應(yīng)信號(hào)堿性磷酸酶*4-MUP*4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根過氧化物酶HPA二聚體3174140.03熒光酶免疫測(cè)定*熒光酶免疫測(cè)定最常用的標(biāo)記酶和熒光底物方法類型

雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法熒光酶免疫測(cè)定方法類型雙抗體夾心法固相抗體和酶標(biāo)記抗體與待檢抗原反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，發(fā)光量與待檢抗原含量成正比。熒光酶免疫測(cè)定（雙抗體夾心法）示意圖熒光酶免疫測(cè)定方法類型雙抗原夾心法固相抗原和酶標(biāo)抗原與待檢抗體反應(yīng)，形成固相抗原-待檢抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光，發(fā)光量與待檢抗體含量成正比。

熒光酶免疫測(cè)定方法類型固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法

待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合定量的酶標(biāo)抗體，洗滌除去未結(jié)合部分，固相抗原與酶標(biāo)抗體形成的復(fù)合物被留下來，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。熒光酶免疫測(cè)定方法評(píng)價(jià)

用酶和熒光底物的化學(xué)反應(yīng)作為放大系統(tǒng)，提高靈敏度背景熒光干擾測(cè)定，用固相熒光酶免疫測(cè)定效果好熒光酶免疫測(cè)定

第四節(jié)

熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

①自身抗體檢測(cè)抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用②病原體檢測(cè)寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）細(xì)菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用③免疫病理檢測(cè)腫瘤（人肝癌細(xì)胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用④細(xì)胞