實(shí)驗(yàn)1-葉綠體的分離與熒光分析

中國(guó)海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：常天易系年級(jí)：海洋生命學(xué)院2012級(jí)專(zhuān)業(yè)：生物科學(xué)科目：分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)號(hào)：12050011006一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、通過(guò)對(duì)植物葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法、觀察葉綠體的間接熒光，并了解熒光顯微鏡的使用方法二、實(shí)驗(yàn)原理顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的黏度有關(guān)。在一定的離心場(chǎng)中，同一時(shí)間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同，一次增加離心力和離心時(shí)間，就能使非均一懸浮液中的顆粒按其大小。密度的先后分批沉降在離心管的底部分批收集，即可獲得各個(gè)亞細(xì)胞的組分。葉綠體的分離應(yīng)該在等滲溶液中進(jìn)行，以免滲透壓影響葉綠體，對(duì)其造成損傷。在熒光顯微鏡下可以觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光。三、實(shí)驗(yàn)材料新鮮菠菜。等滲溶液：0.35mol/L氯化鈉溶液，試劑：0.01%吖啶橙(acridineorange)四、實(shí)驗(yàn)方法１、葉綠體的分離選取新鮮的菠菜葉30.0g，放入150ml的等滲溶液中，在組織搗碎機(jī)中搗碎3min選取新鮮的菠菜葉30.0g，放入150ml的等滲溶液中，在組織搗碎機(jī)中搗碎3min取6層紗布將溶液過(guò)濾于燒杯中，取濾液4ml在1000r/min下離心2min棄去沉淀取6層紗布將溶液過(guò)濾于燒杯中，取濾液4ml在1000r/min下離心2min棄去沉淀將上清液在3000/min中離心5min，棄去上清液，沉淀即是所需的葉綠體將上清液在3000/min中離心5min，棄去上清液，沉淀即是所需的葉綠體 將沉淀用等滲溶液懸浮將沉淀用等滲溶液懸浮2、菠菜葉手撕片的制備①、下表皮因海綿組織較疏松，可以直接手撕下表皮的薄膜在顯微鏡下觀察。游離葉綠體表皮細(xì)胞氣孔保衛(wèi)細(xì)胞游離葉綠體表皮細(xì)胞氣孔保衛(wèi)細(xì)胞圖4葉表皮在藍(lán)光照射下的間接熒光圖6游離葉綠體在綠光照射下的間接熒光圖5游離葉綠體在藍(lán)光照射下的間接熒光圖6游離葉綠體在綠光照射下的間接熒光圖5游離葉綠體在藍(lán)光照射下的間接熒光討論本實(shí)驗(yàn)證明，在1000r/min離心2min，棄去沉淀上清液在3000r/min下離心5min，棄去上清液的差速離心，沉淀含有葉綠體，混有部分細(xì)胞核。在藍(lán)光照射下發(fā)出的間接熒光可見(jiàn)到細(xì)胞核物質(zhì)發(fā)出的綠色熒光。（圖5）在制備菠菜葉手撕片時(shí)，由于下表皮上方的海綿組織較為疏松，所以可以較容易地制得下表皮的手撕片；上表皮下方的柵欄組著較為致密，所以可以通過(guò)從下表皮輕輕地掛掉下表皮和葉肉的方法來(lái)制備上表皮的手撕片。在對(duì)上下表皮的對(duì)比中可以發(fā)現(xiàn)，上表皮的氣孔比下表皮的氣孔更少，上表皮的細(xì)胞間隙比下表皮的細(xì)胞間隙更狹窄；其原因可能是上防止上表皮的水分蒸發(fā)過(guò)于強(qiáng)烈，以保水。菠菜是雙子葉植物，其保衛(wèi)細(xì)胞呈腎形，明顯內(nèi)壁薄，外壁厚，保衛(wèi)細(xì)胞中含有葉綠體，支持淀粉——糖變化學(xué)說(shuō)和蘋(píng)果酸生成學(xué)說(shuō)。在對(duì)菠菜手撕片標(biāo)本在綠光照射下發(fā)出的間接熒光進(jìn)行觀察，葉片的背景顏色呈現(xiàn)紅色，葉綠體處紅色最深，可以較為清晰的顯示出葉綠體的位置；同時(shí)說(shuō)明葉片中還有其他物質(zhì)在綠光的照射下發(fā)出紅色的熒光（圖3）。在對(duì)菠菜手撕片標(biāo)本在藍(lán)光照射下發(fā)出的間接熒光進(jìn)行觀察，葉片的背景顏色呈現(xiàn)綠色，部分呈現(xiàn)紅色，不能清晰的顯示葉綠體的位置。這可能是由于細(xì)胞中的核物質(zhì)在藍(lán)光的照射下造成了綠色的背景（圖4）。７、在綠光照射下游離葉綠體的自發(fā)熒光呈紅色，觀察到的葉綠體數(shù)目較多（圖3），藍(lán)光照射下葉綠體的自發(fā)熒光也呈紅色，觀察到的葉綠體數(shù)目較少（圖5）。８、游離的葉綠體在綠光照射下的間接熒光呈現(xiàn)紅色。９、游離的葉綠體在藍(lán)光照射下下的間接熒光呈現(xiàn)紅色，有部分綠色是細(xì)胞核物質(zhì)在藍(lán)光照射下發(fā)出的。顯示的葉綠體數(shù)目比在藍(lán)光照射下的自發(fā)熒光顯示的數(shù)目多。１０、綜上比較，游離的葉綠體由藍(lán)光照射發(fā)出的間接熒光的顏色強(qiáng)度比手撕片中葉綠體由藍(lán)光照射發(fā)出的間接熒光的顏色強(qiáng)度強(qiáng)，游離的葉綠體由綠光照射發(fā)出的間接熒光的顏色強(qiáng)度和手撕片中葉綠體在由綠光照射發(fā)出的間接熒光的顏色強(qiáng)度差距不大；葉綠體在綠光照射下的熒光顏色強(qiáng)度比同樣標(biāo)本藍(lán)光照射下的熒光顏色強(qiáng)度強(qiáng)；葉綠體在藍(lán)光照射下的間接熒光強(qiáng)度比葉綠體在藍(lán)光照射下的自發(fā)熒光強(qiáng)度強(qiáng)；葉綠體在綠光照射下的間接熒光強(qiáng)度比葉綠體在綠光照射下的自發(fā)熒光強(qiáng)度稍強(qiáng)。七、作業(yè)1.在熒光顯微鏡下，觀察葉綠體的自發(fā)熒光時(shí)，更換濾鏡系統(tǒng)，葉綠體的顏色是否有變化？答：實(shí)驗(yàn)觀察到，在觀察葉綠體自發(fā)熒光時(shí)，在不同的光的照射下，葉綠體的自發(fā)熒光波長(zhǎng)沒(méi)有明顯的變化，因?yàn)槿~綠體在吸收相應(yīng)波長(zhǎng)的光達(dá)到激發(fā)態(tài)時(shí)只會(huì)發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光。綠光為葉綠體的最適激發(fā)波段。在藍(lán)光的照射下，葉綠體的自發(fā)熒光的顏色強(qiáng)度明顯低于在綠光照射下的葉綠體自發(fā)熒光的顏色強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中濾鏡的作用是吸收對(duì)人眼會(huì)造成危害的光線(xiàn)。2.游離葉綠體和整體細(xì)胞內(nèi)的葉綠體，在熒光顯微鏡下，其顏色和強(qiáng)度有無(wú)差異？為什么？答：有。游離葉綠體在藍(lán)光照射下發(fā)出的間接熒光顏色比整體細(xì)胞在藍(lán)光照射下發(fā)出的間接熒光顏色要深，因?yàn)橛坞x葉綠體進(jìn)行光合作用積累了大量的胞內(nèi)物質(zhì)其中大多沒(méi)有被及時(shí)利用，因此其中的糖類(lèi)等物質(zhì)要高于細(xì)胞內(nèi)的葉