低溫脅迫下斑馬魚bmp10-dusp1分子調(diào)控機(jī)制的研究及gsdf轉(zhuǎn)基因品系的構(gòu)建

低溫脅迫下斑馬魚bmp10，dusp1分子調(diào)控機(jī)制的研究及gsdf轉(zhuǎn)基因品系的構(gòu)建魚類作為變溫動(dòng)物,溫度是魚類生存過程中最重要的環(huán)境因素之一,它不僅決定了魚類的分布,且直接和間接的影響著魚類的生理功能和行為。在細(xì)胞和分子水平,低溫不僅會(huì)大大降低酶促反應(yīng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)速率,還會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性、抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯、破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和改變細(xì)胞膜通透性等,此外,冷應(yīng)激還會(huì)改變細(xì)胞脂雙層的特性,包括相變和脂肪酸組成。魚類的鰓組織直接暴露于外環(huán)境中是魚類感知外部環(huán)境壓力的第一個(gè)器官。鰓對魚類適應(yīng)外部環(huán)境溫度的變化和調(diào)節(jié)體內(nèi)生理反應(yīng)起到至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)前期運(yùn)用CRISPR/CAS9技術(shù)分別敲除斑馬魚的bmp10（bonemorphogeneticprotein10,bmp10）和dusp1（dual-specificityphosphatase1,dusp1）基因,發(fā)現(xiàn)bmp10和dusp1在低溫環(huán)境下對斑馬魚的鰓組織凋亡有明顯的調(diào)控作用,但引起凋亡的分子機(jī)制仍不清楚。Bmp10屬于TGF-β超家族成員,已有研究證明bmp10在小鼠心臟發(fā)育過程中具有重要作用,但在斑馬魚的研究中還缺乏相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用CRISPR/CAS9技術(shù)敲除斑馬魚bmp10基因,成功獲得能穩(wěn)定遺傳的F2代,研究發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境下bmp10在魚類鰓組織細(xì)胞凋亡過程中起著重要的調(diào)控作用。但其具體的分子調(diào)控機(jī)制還不清楚。因此,本研究以前期獲得的bmp10^-/-純合突變體斑馬魚為研究對象,發(fā)現(xiàn)與野生型斑馬魚相比,bmp10^-/-純合突變體斑馬魚在低溫環(huán)境下P53蛋白表達(dá)水平明顯增加。同時(shí)bmp10^-/-純合突變體斑馬魚在低溫環(huán)境下P53及其靶基因的mRNA表達(dá)水平會(huì)迅速升高,鰓組織發(fā)生凋亡產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷,加快bmp10^-/-純合突變體斑馬魚的死亡。雙特異性磷酸酶-1（DUSP1/MKP1）作為蘇氨酸-酪氨酸雙特異性磷酸酶家族的成員,最初在培養(yǎng)的鼠科細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。先前的研究表明,dusp1是通過介導(dǎo)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶的去磷酸化作用行使功能。且在細(xì)胞的增殖,分化和凋亡過程中具有重要的調(diào)控作用,本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)dusp1^-/-純合突變體斑馬魚在低溫環(huán)境下鰓組織細(xì)胞的凋亡明顯增加,但引起鰓組織發(fā)生凋亡的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚,本研究通過對前期獲得的dusp1^-/-純合突變體斑馬魚蛋白水平的檢測發(fā)現(xiàn),dusp1^-/-純合突變體斑馬魚在低溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致鰓組織細(xì)胞凋亡顯著增加,主要是由于MAPK通路中的P38和ERK的磷酸化水平增加,從而加快了鰓組織細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致鰓組織產(chǎn)生損傷。Gsdf是TGF-β超家族的一個(gè)特異成員,主要在硬骨魚類雄性性腺中表達(dá),但在精巢發(fā)育過程中的具體分子調(diào)控機(jī)制尚未清楚。因此,本研究以斑馬魚為研究對象,構(gòu)建了以小鼠gamma-crystalin啟動(dòng)子啟動(dòng)的Tg（Crystal-pro-gsdf-2A-egfp）熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,采用顯微注射技術(shù)注射Tg（Crystal-pro-gsdf-2A-egfp）質(zhì)粒至1細(xì)胞期的斑馬魚受精胚胎中。在倒置熒光顯微鏡下觀察和篩選,最終獲得19條能夠在斑馬魚眼部晶狀體特異性表達(dá)綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）的嵌合體F0代,然后將表達(dá)了綠色熒光蛋白的斑馬魚同野生型（WT）非轉(zhuǎn)基因斑馬魚雜交,最終獲得能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)綠色熒光蛋白的F2代。綜上所述,本研究主要揭示了斑馬魚bmp10和dusp1在低溫應(yīng)激過程中鰓組織細(xì)胞凋亡調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制,為研究低溫對魚類生長發(fā)育的影響提供了重要的理論依據(jù)。同時(shí),成功建立了Tg（Crystal-pro-gsdf-2A-egfp）斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系,為觀察和研究gsdf在精巢發(fā)育過程和分子調(diào)控機(jī)制方面的作用提供了新的方法。總之,研究在低溫環(huán)境中的相關(guān)基因?qū)Π唏R魚正常生長發(fā)