酶工程-復(fù)習(xí)資料

第一章

緒論

1.何謂酶工程，試述其主要內(nèi)容和任務(wù)。

酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過程稱為酶工程。

酶工程的主要內(nèi)容包括：微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶，動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶，酶的提取與分離純化，酶分子修飾，酶、細(xì)胞、原生質(zhì)體固定化，酶非水相催化，酶定向進(jìn)化，酶反應(yīng)器和酶的應(yīng)用等。

酶工程的主要任務(wù)是經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作獲得人們所需的酶，并通過各種方法使酶的催化特性得以改進(jìn)，充分發(fā)揮其催化功能。

2.酶有哪些顯著的催化特性？

酶是生物催化劑，與非酶催化劑相比，具有專一性強(qiáng)、催化效率高和作用條件溫和等顯著特點(diǎn)。

3.簡述影響酶催化作用的主要因素。

酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多因素的影響。

5.簡述酶活力單位的概念和酶活力的測定方法。

酶活力單位：在特定條件下（溫度可采用25℃，pH等條件均采用最適條件），每1min催化1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活力單位，這個單位稱為國際單位（IU）。在特定條件下，每秒催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1卡特（kat）

酶活力的測定方法：振蕩測定法，酶柱測定法，連續(xù)測定法，固定化酶的比活力測定，酶結(jié)合效率與酶活力回收率的測定，相對酶活力的測定?；蛘邷y定方法：化學(xué)測定法、光學(xué)測定法、氣體測定法

其它.

酶的發(fā)展歷史：4000多年前的夏禹時代——釀酒技術(shù)。3000多年前的周朝——制造飴糖、食醬等食品。1833年——佩恩和帕索茲從麥芽的水抽提物中得到淀粉酶。19世紀(jì)中葉——巴斯德對酵母的乙醇發(fā)酵進(jìn)行研究。1913年——米徹利斯和曼吞根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說，推導(dǎo)出米氏方程。1926年——薩姆納得到脲酶結(jié)晶，并證明它具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。1960年——雅各和莫諾德提出操縱子學(xué)說。1982年——切克發(fā)現(xiàn)核酸類酶。1983年——阿爾特曼發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶P的RNA部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性。

酶的專一性分為絕對專一性和相對專一性。相對專一性又可分為鍵專一性和基團(tuán)專一性

米氏方程：

酶的可逆性抑制作用可以分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。

Km

增大

不變

減小

Vm

不變

減小

減小

酶的生產(chǎn)方法：提取分離法，生物合成法，化學(xué)合成法第二章

經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作

，利用微生物的生命活動獲得所需要的酶的技術(shù)過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。

酶的發(fā)酵生產(chǎn)是當(dāng)今產(chǎn)酶的主要方法，因為微生物具有種類多、繁殖快、易培養(yǎng)、代謝能力強(qiáng)等特點(diǎn)。

1.

試述酶生物合成的基本過程。

a．

RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄的起始、RNA鏈的延伸、轉(zhuǎn)錄的終止、RNA前體加工成為成熟的RNA分子。

b．

蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽鏈合成的起始、肽鏈的延伸、肽鏈合成的終止、蛋白質(zhì)前體加工修飾成具有特定空間結(jié)構(gòu)的功能蛋白。

2.

何謂酶生物合成的誘導(dǎo)作用？是簡述其原理。

加入某些物質(zhì)使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的現(xiàn)象，稱為酶生物合成的誘導(dǎo)作用。

原理：當(dāng)無誘導(dǎo)物存在時，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，覆蓋RNA聚合酶的結(jié)合部位，RNA聚合酶無法與啟動基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因無法轉(zhuǎn)錄，酶合成受受阻。當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，其與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生改變而降低與操縱基因的結(jié)合能力，RNA聚合酶與啟動基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因正常轉(zhuǎn)錄，相應(yīng)酶得以表達(dá)。

3.

什么是酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔?？試簡述其原理。酶生物合成反饋?zhàn)瓒糇饔弥该复呋磻?yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使酶的生物合成受到阻遏。

原理：無阻遏物存在時，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物阻遏蛋白無法與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因正常轉(zhuǎn)錄，相應(yīng)酶得以正常表達(dá)。當(dāng)阻遏物存在時，其與阻遏蛋白結(jié)合使之空間構(gòu)象發(fā)生改變，阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，抑制RNA聚合酶與啟動基因的結(jié)合，下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄受阻，酶無法正常表達(dá)。4.簡述分解代謝的阻遏作用的原理及解除方法。分解代謝阻遏之所產(chǎn)生，是因為細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)經(jīng)分解代謝產(chǎn)生ATP，ATP則是由ADP和AMP經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)變而來，ATP合成，即意味著胞內(nèi)ADP、AMP濃度下降，cAMP通過水解作用以補(bǔ)充胞內(nèi)AMP濃度，故胞內(nèi)cAMP濃度下降。同時腺苷酸環(huán)化酶活性降低，cAMP合成受阻，致使胞內(nèi)cAMP濃度進(jìn)一步降低。故而cAMP-CAP復(fù)合物濃度隨之降低，啟動基因特定部位無足夠cAMP-CAP復(fù)合物與之結(jié)合從而抑制了RNA聚合酶與啟動基因的結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因無法表達(dá)，酶合成受阻。解除方法：在培養(yǎng)環(huán)境中控制某種易降解物質(zhì)的量，或在必要時添加適量的cAMP。5.酶的生物合成有哪幾種模式？同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型、滯后合成型。6、如何控制微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件？a．保藏的菌種用于生產(chǎn)之前要通過細(xì)胞活化使細(xì)胞的生命活力得以恢復(fù)；b.根據(jù)不同細(xì)胞和不同用途的不同要求配置各營養(yǎng)組分適宜的培養(yǎng)基；c.根據(jù)不同菌種、不同產(chǎn)物、不同工藝條件等不同情況調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH、溫度、溶解氧量使之處于適宜狀態(tài)。7．提高酶產(chǎn)量的措施主要有哪些？

添加誘導(dǎo)物、控制阻遏物濃度、添加表面活性劑、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑。

10.簡述固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)？

提高產(chǎn)酶；可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間；基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定、不易丟失；發(fā)酵穩(wěn)定性好；縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率；產(chǎn)品容易分離純化；適于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。

11.固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶有何特點(diǎn)？

變胞內(nèi)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物；提高產(chǎn)酶率；穩(wěn)定性較好；易于分離純化。第三章動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶2，何為抗體酶？試述獲得抗體酶的主要方法。答：抗體酶又稱為催化性抗體，是一類具有生物催化功能的抗體分子。1）半抗原誘導(dǎo)法。以預(yù)先設(shè)計的過渡態(tài)類似物作為半抗原，與載體蛋白（如牛血清蛋白）偶聯(lián)制成抗原，然后免疫動物，再經(jīng)過單克隆抗體制備技術(shù)制備，分離，篩選得到所需的抗體酶。2）酶蛋白誘導(dǎo)法。是以某種酶蛋白作為抗原誘導(dǎo)抗體酶產(chǎn)生的方法。首先選定一種酶蛋白作為抗原來免疫某種動物，在酶蛋白抗原的誘導(dǎo)下，動物體內(nèi)產(chǎn)生與酶分子特異結(jié)合的抗體；再將獲得的酶抗體來免疫該動物，并采用單克隆抗體制備技術(shù)制備得到與酶抗體特異結(jié)合的抗抗體。那么抗抗體結(jié)合部位的構(gòu)象與用作抗原的酶分子的結(jié)合中心的構(gòu)象相同。對抗抗體進(jìn)行篩選，就有可能獲得具有催化活性的抗體酶。3，植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶有何特點(diǎn)？答：1）產(chǎn)率高。2）生產(chǎn)周期（與完整植株相比較）短，一般為15~30天。3）易于管理，減輕勞動強(qiáng)度。4）提高產(chǎn)品質(zhì)量。5）其他：對剪切力敏感，生產(chǎn)周期長，許多植物細(xì)胞的生長和代謝需要一定的光照。5，試述植物細(xì)胞產(chǎn)酶的工藝條件及其控制。答：1）溫度的控制。一般為25度左右。通常不高于35度，不低于20度。2）PH的控制。一般為PH5.5~5.8。通常介于5.0~6.0的微酸性范圍。3）溶解氧的調(diào)節(jié)控制。一般通過通風(fēng)和攪拌來供給。不能太強(qiáng)烈，以免破壞細(xì)胞。4）光照的控制。根據(jù)植物細(xì)胞的特性及目標(biāo)次級代謝物的種類不同，進(jìn)行光照的調(diào)控。5）前體的添加。為提高次級代謝物產(chǎn)量在培養(yǎng)過程中添加目的代謝物的前體。6）刺激劑的應(yīng)用。促使植物細(xì)胞的物質(zhì)代謝朝著生成某些次級代謝物的方向進(jìn)行，強(qiáng)化次級代謝物的生物合成，提高某些次級代謝物的產(chǎn)率。6，動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中要注意控制哪些工藝條件？答：1）溫度。一般在36.5度，允許波動范圍在0.25度之內(nèi)。2）PH。一般在PH7.4條件下生長最好，通常在7.0~7.6的微堿性范圍內(nèi)。3)滲透壓。一般在700~850kPa范圍內(nèi)。4)溶解氧。一般通過調(diào)節(jié)進(jìn)入反應(yīng)器的混合氣體的量及其比例調(diào)控溶解氧?；旌蠚怏w由空氣，氧氣，氮?dú)猓趸妓姆N氣體組成。二氧化碳兼有調(diào)節(jié)供氧和調(diào)節(jié)PH的雙重作用。7，舉例說明動物細(xì)胞產(chǎn)酶的工藝過程。答：以生產(chǎn)組織纖溶酶原活化劑為例：1）配制人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基。2）人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)：A將人黑色素瘤的種質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶消化處理，細(xì)胞分散后，用PH4.7的磷酸緩沖液洗滌，計數(shù)，稀釋成細(xì)胞懸浮液；B在消毒好的反應(yīng)器中裝進(jìn)一定量的培養(yǎng)液，將上述細(xì)胞懸浮液接種至反應(yīng)器中，接種濃度為1000~3000個細(xì)胞/ml，于37度的CO2培養(yǎng)箱中，通入含5%CO2的無菌空氣，培養(yǎng)至長成單層致密細(xì)胞；C傾去培養(yǎng)液，用PH7.4的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞2~3次；D換入一定量的無血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；E每隔3~4天，取出培養(yǎng)液進(jìn)行tPA（組織纖溶酶原活化劑）的分離純化；F再向反應(yīng)器中加入新鮮的無血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得大量tPA。3）組織纖溶酶原活化劑的分離純化。在獲得的上述培養(yǎng)液中加入一定量的蛋白酶抑制劑和表面活性劑，過濾去沉淀，適當(dāng)稀釋后，采用親和層系技術(shù)進(jìn)行分離，得到tPA溶液。經(jīng)過濃縮，葡聚糖G-150凝膠層次，冷凍干燥，得到精制tPA干粉。第四章

1細(xì)胞破碎的方法：機(jī)械破碎法

通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生剪切力，使組織

細(xì)胞破碎

物理破碎法

通過各種物理因素，使組織

細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎

化學(xué)~

通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，從而使細(xì)胞破碎

酶促~

通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，從而達(dá)到細(xì)胞破碎

2.酶提取主要方法：

鹽溶液提取

酸~

堿~

有機(jī)溶劑提取

3

酶沉淀分離方法的原理

P-91

表4-3

特點(diǎn)：鹽析法

主要用于蛋白類酶的分離純化，鹽析時，溫度一般維持室溫，對溫度敏感的酶應(yīng)低溫條件，溶液的PH應(yīng)調(diào)到欲分離的酶等電點(diǎn)附近

等電點(diǎn)

主要用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。加酸或加堿的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加，以防局部過酸或過堿，引起酶變性失活。

有機(jī)溶劑

分離效果受溶液PH的影響。該方法比鹽析法洗出的沉淀易于離心或過濾分離，不含無極鹽，分辨率也高，但容易引起酶變性失活，所以必須在低溫條件下操作，而且沉淀析出后要盡快分離，減少有機(jī)溶劑對酶的影響

復(fù)合`~

復(fù)合沉淀劑與酶形成復(fù)合物，溶解度降低選擇性~

對酶沒有明顯影響

4

膜分離技術(shù)

借助一定孔徑的高分子膜，將不同大小

不同形狀

不同特征的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為~

應(yīng)用

超濾

蛋白質(zhì)除鹽

濃縮及分離純化

反滲透

海水淡化

電場膜分離：脫鹽

海水淡化純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸，谷氨酸及凝膠電洗脫。

5

超臨界萃取

又稱超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)

特點(diǎn)

P-129

雙水相萃取

利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中溶解度不同而達(dá)到分離

特點(diǎn)P-128影響因素第3段

6

離子交換層析

利用離子交換劑的可解離集團(tuán)對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的一種層析分離方法。

要點(diǎn)

離子交換劑的選擇

處理

裝柱

上柱

洗脫和收集

再生

親和層析

利用生物分子與配基之間所具有的可逆親和力，使生物分子分離純化的技術(shù)

控制好溫度

PH等條件，以免酶失活

母體和配基的偶聯(lián)結(jié)合

凝膠層析

利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)

操作要點(diǎn)

制備膠時，防止氣泡產(chǎn)生，為此將各種所需比例的貯存液混合以后，應(yīng)該抽氣處理

2

洗脫液體積一般為凝膠床體積的120%

3上柱體積為凝膠床10%，不得超過30%

凝膠的選擇與處理

裝柱

上柱

洗脫

7

連續(xù)凝膠電泳：只用一層凝膠，采用相同的PH和相同的緩沖液

不連續(xù)凝膠電泳：采用2或3層性質(zhì)不同的凝膠重疊起來使用，采用2中不同的PH和不同緩沖液，能使?jié)舛容^低的各種組分在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨率

梯度連續(xù)凝膠電泳：采用自上而下濃度逐漸升高，孔徑逐漸減小的梯度凝膠電泳。主要測定球類蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量

SDS-凝膠電泳

巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，SDS能使蛋白質(zhì)分子的請柬，疏水鍵打開，并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合。為此，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物遷移速率不再受蛋白質(zhì)原有電荷及分子形狀影響，只取決于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。

8

酶結(jié)晶方法

鹽析~

有機(jī)溶劑~

透析平衡~

等電點(diǎn)~

溫度差~

金屬離子復(fù)合~

9

技術(shù)

：細(xì)胞破碎

提取

細(xì)心分離

過濾與膜分離

沉淀分離

層析分離電泳分離

萃取分離

濃縮

干燥

結(jié)晶第五章——酶的分子修飾

1，試述酶分子修飾的概念和作用

答：概念：通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變從而改變酶的催化活性的技術(shù)過程。

作用：酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些合理改變有可能提高酶的催化效率，增加酶的穩(wěn)定性，降低或消除酶的抗原性，改變酶的底物專一性。同時在酶學(xué)和酶工程研究方面具有重要的意義。

2，何謂金屬離子置換修飾？簡述其主要修飾過程和作用

答：概念：把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法。

過程：酶的分離純化，除去原有的金屬離子，加入置換離子

作用：1，闡明金屬離子對酶的催化作用的影響

2，提高酶的催化效率

3，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性

4，改變酶的動力學(xué)特性

3，何謂大分子結(jié)合修飾？有何作用？

答：概念：采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價結(jié)合，使酶的分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法。

作用：1，通過修飾提高酶的催化效率

2，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性

3，通過修飾降低或消除酶蛋白的抗原性

4，簡述定點(diǎn)突變技術(shù)的主要技術(shù)過程及其在酶分子修飾中的應(yīng)用

定點(diǎn)突變：指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變，從而獲得突變基因的操作技術(shù)

過程：1，新酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計

2，突變基因堿基序列的確定

3，突變基因的獲得

4，新酶的獲得

應(yīng)用：定點(diǎn)突變技術(shù)為氨基酸置換修飾和核苷酸置換修飾提供了先進(jìn)可靠行之有效的手段。

抗體酶：是一類具有催化功能的抗體

第六章

1953年德國的格魯布霍費(fèi)（Grubhofer）和施萊恩（Schleith）采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，經(jīng)重氮化法活化后，分別與羧肽酶，淀粉酶，胃蛋白酶，核糖核酸酶等結(jié)合而制成固化酶。

固定化酶是指固定在一定載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。

固定化方法：吸附法，包埋法，結(jié)合法，交聯(lián)法和熱處理法等。

吸附法：利用各種固體吸附將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。

包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定的方法。包括凝膠包埋法和半透膜包埋法。

結(jié)合法：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定方法稱為結(jié)合法。

交聯(lián)法：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，生成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶法稱為交聯(lián)法。

熱處理法：將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內(nèi)而制備得到固定化酶的方法。（只適應(yīng)熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化）

固化酶特性：

1.

穩(wěn)定性（1）熱穩(wěn)定性提高（2）保存穩(wěn)定性好（3）對蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)不易被蛋白酶水解（4）對變性劑的耐受性提高

2.

最適溫度

與游離酶差不多，活化能變化不大，部分固化酶最適溫度與游離酶相比，有明顯變化。

3.

最適PH

影響固化酶PH因素主要有兩個（1）載體帶電性質(zhì)，明顯影響。（2）產(chǎn)物性質(zhì)對最適PH影響，有一定影響

4.

底物特異性

不同于游離酶，其變化與底物分子質(zhì)量的大小有一定關(guān)系。

固化酶應(yīng)用：

工業(yè)產(chǎn)業(yè)，醫(yī)藥，食品，輕工，分析，環(huán)保，能源和科學(xué)研究

通過各種方法將細(xì)胞固定在水不溶性的載體上，紙杯固定化細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞固定化。

特點(diǎn)：提高產(chǎn)率，增加穩(wěn)定性，利于分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

固定化微生物細(xì)胞應(yīng)用：發(fā)酵和制成微生物電極

固定化植物細(xì)胞：人工種子，生產(chǎn)色素，香精

固定化動物細(xì)胞：生產(chǎn)疫苗

第七章

1.

簡述酶非水相催化的概念與特點(diǎn)？

答：酶在非水介質(zhì)中的催化作用稱為酶的非水相催化。它是通過改變反應(yīng)介質(zhì)，影響酶的表面結(jié)構(gòu)和活性中心，從而改變酶的催化特性。主要內(nèi)容包括有機(jī)介質(zhì)中的酶催化，氣相介質(zhì)中的酶催化，超臨界流體介質(zhì)中的酶催化和離子液介質(zhì)中的酶催化等。由于在非水相介質(zhì)中酶分子受到非水介質(zhì)的影響，起催化特性與在水相中的有較大的不同。酶在有機(jī)介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性比在水溶液中有顯著地提高，而且催化時，酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵的選擇性和熱穩(wěn)定性都有所改變，同時酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵的選擇性等顯著特點(diǎn)。

2.

酶在有機(jī)溶劑介質(zhì)中與在水溶液中的特性有何改變？

答：⑴底物專一性：酶在水溶液中進(jìn)行催化反應(yīng)時，具有高度的底物專一性，或稱為底物特異性，是酶催化反應(yīng)的顯著特點(diǎn)之一。在有機(jī)介質(zhì)中，由于酶分子活性中心的結(jié)合部位與底物之間的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生了某些變化，致使酶的底物特異性發(fā)生改變。⑵對稱體選擇性：酶在有機(jī)介質(zhì)中催化，由于介質(zhì)的特性發(fā)生改變，從而引起酶的對稱體選擇性也發(fā)生改變。酶在水溶液中催化的立體選擇性較強(qiáng)，而在疏水性強(qiáng)的有機(jī)介質(zhì)中，酶的立體選擇性較差。⑶區(qū)域選擇性：酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化時，具有區(qū)域選擇性，即酶能夠選擇底物分子中某一區(qū)域的基團(tuán)優(yōu)先進(jìn)行反應(yīng)。⑷鍵選擇性：在同一個底物分子中有兩種以上的化學(xué)鍵都可以與酶反應(yīng)時，酶對其中一種化學(xué)鍵優(yōu)先進(jìn)行反應(yīng)。⑸熱穩(wěn)定性：許多酶在有機(jī)介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性比在水溶液中的熱穩(wěn)定性更好。在有機(jī)介質(zhì)中，酶的熱穩(wěn)定性之所以增強(qiáng)，可能是由于有機(jī)介質(zhì)中缺少引起酶分子變性失活的水分子所致。⑹PH特性：在水溶液中，緩沖液的PH決定了酶分子活性中心基團(tuán)的解離狀態(tài)和底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合和催化反應(yīng)。在有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)中，酶所處的PH環(huán)境與酶在凍干或吸附到載體上之前所用的緩沖液PH相同（這種現(xiàn)象稱為PH印記或PH記憶）。酶在有機(jī)介質(zhì)中催化反應(yīng)的最適PH通常與酶在水溶液中反應(yīng)的最適PH接近或者相同。

3.

什么是必需水和水活度？水對非水相中酶的特性有何影響？

答：必需水：維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水。

水活度（Aw）：是指體系中水的逸度與純水逸度之比。通?？梢杂皿w系中水的蒸汽壓與相同條件下純水的蒸汽壓之比表示。即Aw=P/P0

式中，P為在一定條件下體系中水的蒸汽壓；P0為在相同條件下純水的蒸汽壓。

影響：⑴水對酶分子空間構(gòu)象的影響：酶分子只有在空間構(gòu)象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間構(gòu)象被破壞，酶將變性失活。所以，酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構(gòu)象。⑵水對酶催化反應(yīng)速度的影響：有機(jī)介質(zhì)中水的含量對酶催化反應(yīng)速度有顯著影響。有的酶在水含量較低的條件下，酶的催化反應(yīng)速度隨水含量的增高而升高。在催化反應(yīng)速度達(dá)到最大時的水含量稱為最適水含量。⑶在有機(jī)介質(zhì)體系中，酶的催化活性會隨著結(jié)合水量的增加而提高。在結(jié)合水量不變的條件下，體系中水含量的變化對酶的催化活性影響不大。

4.有機(jī)溶劑對酶催化有何影響？

答：⑴有機(jī)溶劑對酶結(jié)構(gòu)與功能的影響：有機(jī)溶劑對酶分子表面結(jié)構(gòu)的影響；有機(jī)溶劑對酶活性中心結(jié)合位點(diǎn)的影響，主要是通過有機(jī)溶劑與底物競爭活性中心的結(jié)合位點(diǎn)，降低底物的結(jié)合能力，從而影響酶的催化活性。⑵有機(jī)溶劑對酶活性的影響：極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑會奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性，甚至引起酶的變性失活。⑶有機(jī)溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響：有機(jī)溶劑極性過大或過小都會影響底物的濃度從而影響酶的催化速度。

5.如何控制有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件？

答：⑴對酶的選擇不但要看催化反應(yīng)速度的大小，還要特別注意酶的穩(wěn)定性、底物專一性、對映體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性等⑵底物的選擇和濃度控制：根據(jù)酶在所使用的有機(jī)介質(zhì)中的專一性選擇適宜的底物并且使底物濃度持續(xù)維持在一定的濃度范圍內(nèi)。酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化時，要考慮底物在有機(jī)溶劑和必需水層中的分配情況。⑶有機(jī)溶劑的選擇：它的極性選擇要恰當(dāng)，不能過強(qiáng)或過弱。⑷水含量的控制：使反應(yīng)體系保持在最適水含量。⑸溫度控制：最好在最適溫度。⑹PH的控制：保持在最適PH，可以通過調(diào)節(jié)緩沖溶液的PH和離子強(qiáng)度的方法對有機(jī)介質(zhì)中酶催化的PH和離子強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。

6.舉例說明酶非水相催化的應(yīng)用？

答：⑴手性藥物的拆分

⑵手性高分子聚合物的制備

⑶

酚樹脂的合成

⑷

導(dǎo)電有機(jī)聚合物的合成

⑸

發(fā)光有機(jī)聚合物的合成

⑹食品添加劑的生產(chǎn)

⑺

生物柴油的生產(chǎn)

⑻多肽的合成

⑼甾體轉(zhuǎn)化

知識點(diǎn)：

（1）酶可以在水與有機(jī)溶劑的互溶體系中進(jìn)行催化反應(yīng)；也可以在水和有機(jī)溶劑組成的雙液相體系中進(jìn)行催化反應(yīng)；還可以在只含有微量水的有機(jī)介質(zhì)，又稱為微水介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)。

（2）非水酶學(xué)就是酶非水相催化。

（3）酶的非水相催化≠酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化。

（4）在酶的非水相催化中，研究最多的非水介質(zhì)是有機(jī)溶劑。有機(jī)介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。

（5）有機(jī)介質(zhì)體系包括：（1）微水介質(zhì)體系（2）與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系（3）與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或體系（4）正膠束體系（5）反膠束體系。

微水介質(zhì)體系是由有機(jī)溶劑和微量的水組成的反應(yīng)體系，是在有機(jī)介質(zhì)酶催化中廣泛應(yīng)用的一種反應(yīng)體系。通常所說的有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系主要是指微水介質(zhì)體系。

能在與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系中進(jìn)行催化反應(yīng)的酶較少。

膠束又稱為正膠束或正膠團(tuán)，是在大量水溶液中含有少量與水不相混溶的有機(jī)溶劑，加入表面活性劑后形成的水包油的微小液滴。表面活性劑的極性端朝外，，非極性端朝內(nèi)，有機(jī)溶劑被包在液滴內(nèi)部。

反膠束又稱為反膠團(tuán)，是指在大量與水不相混溶的有機(jī)溶劑中，含有少量的水溶液，加入表面活性劑后形成的油包水的微小液滴。表面活性劑的極性端朝內(nèi)，，非極性端朝外，水溶液包在膠束內(nèi)部。

不管采用何種有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系，酶催化反應(yīng)的介質(zhì)中都含有有機(jī)溶劑和一定量的水。

（6）在有機(jī)介質(zhì)中，脂肪酶可以催化油脂與甲醇的酯交換反應(yīng)，生成生物柴油。

第八章

酶定向進(jìn)化

思考題

1.酶定向進(jìn)化:是模擬自然進(jìn)化的過程，在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性酶的突變體的技術(shù)過程。

酶定向進(jìn)化的特點(diǎn)：1適應(yīng)面廣、目的性強(qiáng)、效果顯著。

酶定向進(jìn)化的基本過程包括隨機(jī)突變、構(gòu)建突變基因文庫、酶突變基因的定向選擇等步驟。

2.易錯PCR

是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時，通過調(diào)整反應(yīng)條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等，增加堿基配對錯誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。通常，經(jīng)一次突變的基因很難獲得滿意的結(jié)果，由此可以采反復(fù)多次易錯PCR方法。即將一次易錯PCR擴(kuò)增得到的正突變基因作為下一次易錯的模板，在進(jìn)行易錯PCR,如此反復(fù)進(jìn)行，直至獲得較為滿意的結(jié)果為止。

3.DNA重排技術(shù)是從正基因突變文庫中分離得到的同源DNA,用酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。

DNA重排技術(shù)將兩條或多條正突變基因通過脫氧核糖核酸酶等酶的作用，隨機(jī)切割成若干DNA片段，然后將這些隨機(jī)片段在不加引物的條件下經(jīng)過多次PCR循環(huán)，使這些DNA隨機(jī)片段互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增、延伸，再加入適宜的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得全長的基因。經(jīng)過一次DNA重排獲得的突變基因往往未能達(dá)到人們的要求，為此，需要經(jīng)過構(gòu)建突變文庫和篩選的過程，獲得的正突變基因在反復(fù)經(jīng)過上述步驟，直到獲得所需的突變基因為止。

4.基因家族重排技術(shù)：是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶切割成隨機(jī)片段，將經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。

基因家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的基本過程大致相同，都要經(jīng)過基因的隨機(jī)切割、無引物PCR等步驟以獲得突變基因，然后通過構(gòu)建突變基因文庫、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。

基因家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的主要不同點(diǎn)在于前者從基因家族的若干同源基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布，而后者則從采用易錯PCR等技術(shù)所獲得的兩個以上的正突變基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布。

其他內(nèi)容：

體外隨機(jī)突變的技術(shù)主要有：易錯PCR技術(shù)、DNA重排技術(shù)、基因家族重排技術(shù)。

易錯PCR技術(shù)所引起的基因突變和遺傳進(jìn)化僅在單一分子內(nèi)發(fā)生，所以屬于無性進(jìn)化。

DNA重排技術(shù)將存在于兩種或多種不同基因中的正突變結(jié)合在一起，通過DNA堿基序列的重新排布，形成新的突變基因，屬于用性進(jìn)化。

突變基因文庫的構(gòu)建是將各種不同的突變基因與載體重組，再轉(zhuǎn)入適宜的細(xì)胞或包裝成重組λ噬菌體的技術(shù)過程。

構(gòu)建突變基因文庫的過程主要包括載體的選擇、基因重組、形成基因文庫等。

高通量篩選技術(shù)包括：平板篩選法、熒光篩選法、噬菌體表面展示法、酵母細(xì)胞面展示法。

第九章

1.

酶反應(yīng)器的類型：攪拌罐式反應(yīng)器，鼓泡式反應(yīng)器，填充床式反應(yīng)器，流化床式反應(yīng)器，膜反應(yīng)器

2.

選擇酶反應(yīng)器的主要依據(jù)有：根據(jù)酶的應(yīng)用形式選擇；根據(jù)酶反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)選擇；根據(jù)底物或產(chǎn)物的理化性質(zhì)選擇；其他影響因素：所選擇的反應(yīng)器應(yīng)當(dāng)能夠適用于多種酶的催化反應(yīng)，并能滿足酶催化反應(yīng)所需的條件，并可進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)控制。

3.

酶反