膠體金試紙條的制備

免疫膠體金技術(shù)簡介Immunecolloidalgoldtechnique2021-1-27整理課件目錄1膠體金技術(shù)的種類2膠體金的合成3膠體金的標記與純化4膠體金免疫層析法試劑的組成5膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用7膠體金技術(shù)的開展膠體金免疫層析試紙的檢測模式6整理課件膠體金免疫層析〔GoldImmune–ChromatographicAssay,GICA〕技術(shù)是結(jié)合了膠體金技術(shù)和免疫層析技術(shù)開展而來的，其本質(zhì)為一種固相反響的ELISA,并用膠體金來代替底物顯色。免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。膠體金標記實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒外表的包被過程。整理課件膠體金技術(shù)的開展

1939-----雛形Kausche等把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電子顯微鏡下觀察金離子呈高電子密度。1971------作為標記物應(yīng)用于免疫組織化學(xué)研究Faulk等首先將兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門菌的外表抗原。1974------實現(xiàn)間接免疫金染色法Romano將膠體金標記到馬抗人的IgG上，實現(xiàn)了間接免疫金染色法整理課件膠體金技術(shù)的種類及優(yōu)點快速免疫金滲濾法(immuogoldfiltrationassay,IGFA)即穿流式(flowthrough)的固相膜免疫測定。主要由兩局部組成：膜滲濾裝置和標記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標記結(jié)合物為免疫金。A：金標記抗體B：標本中的抗原C：包被抗體D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒整理課件

免疫層析法(immunochromatogra-phy，ICA)是繼IGFA之后開展起來的另一種固相膜免疫測定，與IGFA利用微局限性膜的過濾性能不同，免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細管作用(基于層析作用的橫流〔lateralflow〕)向另一端移動。移動過程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無關(guān)物質(zhì)那么越過該區(qū)域而被別離，然后通過標記物顯色來判定試驗結(jié)果，以膠體金為標記物的實驗稱為膠體金免疫層析試驗。整理課件免疫膠體金技術(shù)的特點優(yōu)點：檢測方法簡單而快速，數(shù)分鐘即可得出結(jié)果；不需儀器設(shè)備，操作人員不需特殊訓(xùn)練；試劑穩(wěn)定，適用于單份測定；無污染；GICA的特點是單一試劑，一步操作。小型實驗室即有條件開發(fā)生產(chǎn)。枯燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。

成為目前“病人身邊檢驗〞〔point-of-caretesting，POCT〕中廣為應(yīng)用的方法。整理課件最近由于原料的精選和制作工藝的改進，已能制備出可用于定量測定的GICA試劑。Roche公司生產(chǎn)的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡便測讀器CardiacReader，其精密度和準確性均符合定量測定要求。缺乏：金免疫測定中應(yīng)用的是單份試劑，難于進行質(zhì)量控制。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個試劑的同一性。因此金免疫測定一般只能用于定性試驗。其定量檢測和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開發(fā)與應(yīng)用。整理課件膠體金的合成①白磷復(fù)原法(1905年)可合成3nm左右大小的金顆粒；②白磷復(fù)原法(1925年)經(jīng)改進后，可合成5～12nm大小的金顆粒；③抗壞血酸復(fù)原法(1958年)可合成6～13nm大小的金顆粒；④檸檬酸三鈉復(fù)原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金顆粒；⑤乙醇—超聲波復(fù)原法(1980年)可合成6～10nm大小的金顆粒；⑥硼氫化鈉復(fù)原法(1982年)可合成3—17nm大小的金顆粒；⑦單寧酸—檸檬酸三鈉復(fù)原法(1985年)可合成3～17nm大小的金顆粒。整理課件膠體金合成將100ml的0.1％H2AuCl4參加200ml的錐形瓶中，并將其置于攪拌電熱爐上，參加一個磁力條并將溶液加熱至沸騰。向沸騰的溶液中參加1.5ml的0.1％二合水檸檬酸三鈉，Na3C6H5O7.2H2O當獲得深紅顏色的溶液時停止加熱制備膠體金試紙條常用的一般是檸檬酸三鈉復(fù)原法整理課件膠體金粒徑（nm）1％檸檬酸三鈉加入量（ml）*呈色λmax162.00橙色518nm24.51.50橙紅522nm411.00紅色525nm71.50.70紫色535nm膠體金的合成整理課件本卷須知

〔1〕氯金酸易潮解，應(yīng)枯燥、避光保存。

〔2〕氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。

〔3〕用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。

〔4〕是以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后枯燥備用。整理課件膠體金的質(zhì)量鑒定優(yōu)質(zhì)金顆粒和劣質(zhì)金顆粒

劣質(zhì)金外形不均一，且非球形，有凝集現(xiàn)象，顆粒間變異系數(shù)較大。透射電鏡下觀察其顆粒大小及均勻度理想的金顆粒大小根本相等，均勻一致，無橢圓形及多角形的金顆粒存在。整理課件雙電層結(jié)構(gòu)保證了膠體金的穩(wěn)定性，使金顆粒始終以懸浮狀態(tài)存在。膠體金溶液通常由呈單一分散狀態(tài)的金顆粒組成，金顆粒直徑在1-100nm之間，而穩(wěn)定的金溶液那么要求金顆粒維持在某一固定直徑不變。蛋白通常帶有多種電荷，當?shù)鞍讕д姇r，能與膠體金所帶的負電荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通過疏水作用將蛋白結(jié)合至金顆粒外表；有些蛋白那么可通過半胱氨酸的巰基與金顆粒共軛連接。膠體金的蛋白標記整理課件金標樣本程序?qū)⒛z體金調(diào)整至正確的pH值確定最小蛋白含量最終結(jié)合〔標記〕純化整理課件膠體金調(diào)整正確的pH值

膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標記蛋白質(zhì)的等電點略偏堿。

需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1NHCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可.整理課件常見蛋白標記條件整理課件最小蛋白用量確實定〔1〕光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液〔1ml〕，分別參加5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各參加1ml10%NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520～580nm之間測定，以O(shè)D值為縱坐標，蛋白質(zhì)用量為橫坐標作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最適穩(wěn)定量為45μg/ml。整理課件〔2〕目測法：以目測法確定膠體金與待標記蛋白質(zhì)用量比例，將標記的蛋白質(zhì)逐級稀釋后〔由5μg～45μg另設(shè)對照管〕，各取等體積順序參加一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別參加0.1ml10%氯化鈉，依表順序進行。整理課件發(fā)現(xiàn)1、2號管出現(xiàn)黑色沉淀且紅色全部褪去，3號管雖然能保持紅色，但是管底也出現(xiàn)了一定量的黑色沉淀，而4、5號管顏色無變化與對照顏色一致，最低蛋白量即為4號管的蛋白量。整理課件最終結(jié)合〔McAb〕取100ml金溶液，調(diào)整pH值至8.2調(diào)整濾過和離心的抗體溶液〔0.1μg/μl〕至pH8.2當金溶液在快速攪拌時要逐滴參加定量的抗體〔蛋白最小濃度量加10%即蛋白穩(wěn)定量〕，大約5分鐘加完在金標溶液中參加10ml濾過的10％BSA至終濃度為1%，并輕輕攪拌10分鐘。整理課件純化超速離心法、凝膠過濾法膠體金顆粒/nmpH標記蛋白質(zhì)離心力/g時件/min59.0羊抗人IgG4500045108.2McAb4500030156.5鏈霉親和素12000045206.0SPA12000030109.0羊抗兔IgG12000060幾種免疫金探針離心純化條件整理課件膠體金免疫層析法試劑的組成整理課件樣品墊(Samplepad)：玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。樣品墊的作用：減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結(jié)合墊上均勻分布；去除樣品中雜質(zhì)顆粒；調(diào)節(jié)樣品液pH值或粘度等。樣品墊可使用化學(xué)物質(zhì)進行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗的靈敏度。通?？梢詫⑾礈靹?、粘性增強劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以枯燥，該工藝可防止使用復(fù)雜辨識劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測一步完成。整理課件結(jié)合墊(Conjugatepad)：玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結(jié)合墊的作用主要為：

-吸附一定量的金標結(jié)合物顆粒；

-吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上；

-保持金標結(jié)合物顆粒的穩(wěn)定性；

-保證金標結(jié)合物顆粒定量完全釋放等。玻璃纖維膜/聚酯纖維膜整理課件硝酸纖維素膜(Nitrocellulose)：一般使用Millipore，MDI，S&S，whatman等國外公司的硝酸纖維素膜。

NC膜的作用：

-在檢測線和對照線條帶區(qū)域固定抗體；-樣品在NC膜上流動并與試劑混合發(fā)生免疫反響；-反響在NC膜上顯色，讀檢測結(jié)果NC膜的重要參數(shù)：孔徑、對稱性、層析速度、外表活性劑、蛋白結(jié)合力、強度、外表質(zhì)量、厚度、批間均一性等。整理課件硝酸纖維膜的選擇膜的分類標準(μm和s)μm:指的是膜孔徑換算情況大致為：8μm=135s；6μm=180s不同秒數(shù)的膜對反響的影響通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反響時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反響時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反響時間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反響不一定就能夠真正的提升靈敏度。

135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法.整理課件片材：

不干膠塑料襯底，片材的質(zhì)量很大程度上影響了產(chǎn)品的貨架期。吸收墊(AbsorbentPad)：提供高吸收率、高容量以及相對穩(wěn)定吸收率的吸收紙；吸收紙的作用：

主要表現(xiàn)在控制樣品的流速，促進虹吸作用以及使試劑跨過膜而不僅僅移到膜上。整理課件膠體金免疫層析試紙模式雙抗體夾心模式疫病抗原檢測競爭模式小分子物質(zhì)檢測SPA/蛋白G模式疫病抗體檢測整理課件雙抗體夾心模式判定檢測線質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色整理課件競爭模式判定檢測線質(zhì)控線陽性不顯色顯色陰性顯色顯色整理課件SPA/G蛋白模式判定檢測線質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色整理課件膠體金免疫層析試紙質(zhì)量檢測整理課件膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用Zhang等用克倫特羅制備的單克隆抗體標記膠體金作為檢測探針，然后將偶聯(lián)BSA的克倫特羅作為T線，以競爭模式組裝成試紙，用于樣品的克倫特羅殘留檢測，為我國食品平安檢測提供了有效的工具。之后Zhang的團隊采用同樣的模式制備并組裝成功兩類獸藥殘留檢測試紙，分別為磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星殘留檢測膠體金免疫層析試紙，為我國獸藥殘留快速檢測技術(shù)的開展奠定了根底。在獸醫(yī)疫病檢測中的應(yīng)用Bhakar等應(yīng)用相應(yīng)的單抗標金，建立了阿米巴蟲抗原檢測方法。Kameyama等