【生物課件】重組DNA技術(shù)的基本工具 2023-2024學(xué)年高二（人教版2019選擇性必修3）

教學(xué)目標(biāo)：1、闡明重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用。2、認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。3、進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定教學(xué)重點(diǎn)：1、重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具的作用

2、DNA的粗提取與鑒定。教學(xué)難點(diǎn)：

1、基因工程載體需要具備的條件。2、DNA的粗提取與鑒定。圖解“基因工程實(shí)質(zhì)”轉(zhuǎn)移A生物B生物螢火蟲普通動植物發(fā)光基因基因工程的概念指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做重組DNA技術(shù)?；蚬こ痰恼Q生和發(fā)展轉(zhuǎn)基因抗蟲棉蘇云金桿菌中的Bt基因基本原理普通棉花細(xì)胞含Bt基因的棉花細(xì)胞能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白的棉花植株轉(zhuǎn)入植物組織培養(yǎng)技術(shù)形成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對轉(zhuǎn)基因工程的分析蘇云金桿菌中的Bt基因基本原理普通棉花細(xì)胞含Bt基因的棉花細(xì)胞能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白的棉花植株轉(zhuǎn)入植物組織培養(yǎng)技術(shù)形成目的基因1受體細(xì)胞2目的基因表達(dá)產(chǎn)物3兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)4在實(shí)驗(yàn)中研究或操縱的可以帶來預(yù)期性狀的基因用來接受目的基因以定向改造某種性狀的細(xì)胞目的基因在受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯出來的產(chǎn)物不同來源的DNA進(jìn)行重新組合形成一個DNA重組的DNA分子在受體細(xì)胞里能表達(dá)出產(chǎn)物操作原理操作對象操作水平操作環(huán)境操作結(jié)果工程優(yōu)點(diǎn)基因重組基因DNA分子水平生物體外獲得新的生物類型和生物產(chǎn)品克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙定向改變生物的性狀基因工程誕生的理論基礎(chǔ)拼接的基礎(chǔ)1.DNA的基本組成單位相同（四種脫氧核苷酸）表達(dá)的基礎(chǔ)2.都遵循堿基互補(bǔ)配對原則3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位2.遺傳信息的傳遞都遵循中心法則3.生物界幾乎共用一套遺傳密碼基因在空間上轉(zhuǎn)移并成功表達(dá)接剪運(yùn)1.DNA的基本組成單位相同(都是四種脫氧核苷酸)2.都遵循堿基互補(bǔ)配對原則3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)表達(dá)的基礎(chǔ)1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位2.遺傳信息傳遞都遵循中心法則3.生物界幾乎共用一套遺傳密碼重組DNARNA蛋白質(zhì)性狀復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯拼接的基礎(chǔ)第3章基因工程第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具轉(zhuǎn)基因抗蟲棉接剪運(yùn)限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）1、來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。2、作用：識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。1’2’3’4’5’

G1’2’3’4’5’

A磷酸二酯鍵TGCCGTAA5'3'5'3'3、作用位點(diǎn)：

只切割兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。EcoRI(在G與A之間切割)SmaI(在G與C之間切割)5'5'5'5'3'3'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）

大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）4、作用結(jié)果：形成黏性末端和平末端限制酶所識別的序列的特點(diǎn)是：

呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。在切割部位，一條鏈從5’往3’讀的堿基順序與另一條鏈5’往3’讀的順序完全一致暮天遙對寒窗霧；霧窗寒對遙天暮。寫出下列限制酶切割形成的黏性末端GATCAATTAGCTGATC總結(jié)

不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端同尾酶

識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制酶是如何命名的呢？是用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。從大腸桿菌（Escherichiacoli）的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoRI流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindIHindIIHindIII1、你能根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身安全。2、試推測限制酶為什么不會切割自身的DNA？原核生物中不存在該酶的識別序列，或識別序列已被修飾使限制酶不與之結(jié)合旁欄思考題二、DNA連接酶——“分子縫合針”1、作用：將切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子。2、實(shí)質(zhì)：

恢復(fù)兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。DNA連接酶注：DNA連接酶不作用于氫鍵二、DNA連接酶——“分子縫合針”類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能只縫合____________

縫合____________和____________結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯鍵思考T4DNA連接酶連接平末端的效率和連接黏性末端的效率相同嗎？不同，因?yàn)轲ば阅┒说膲A基是互補(bǔ)的，在連接時，黏性末端可以通過堿基互補(bǔ)配對，加快DNA連接酶的連接速度，而平末端則不能。3、種類和作用：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?DNA連接酶AG

T

AC

TA

A

T

DNA母鏈DNA聚合酶DNA聚合酶T……T……A……A……T……A……T……C………G………旁欄思考題項(xiàng)目DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對象作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶與DNA聚合酶的比較與DNA相關(guān)的五種酶的比較酶1酶2酶4酶3酶5酶1:限制酶酶2:DNA連接酶酶3:DNA解旋酶酶4:DNA聚合酶酶5:DNA水解酶三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1、作用：將外源基因送入受體細(xì)胞2、種類：①質(zhì)粒——最常用擬核DNA質(zhì)粒大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因目的基因插入位點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。②噬菌體、動植物病毒等動物病毒噬菌體種類用途不同點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體擬核DNA質(zhì)粒大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因目的基因插入位點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體3、作為載體需要具備的條件：②自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制①有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)④對受體細(xì)胞無害③具有多種特殊的標(biāo)記基因如：抗生素抗性基因；熒光蛋白基因思考·討論：重組DNA分子請你在上述序列中EcoRⅠ的識別序列和切割位點(diǎn)。然后，用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠帶將切口粘起來。剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？

根據(jù)學(xué)生實(shí)際操作的情況進(jìn)行指導(dǎo)。如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對，也可能是其他原因。不能，因?yàn)榛虻拈L度一般在100個堿基對以上。剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。目的基因和載體隨意連接（反向連接）、目的基因自身環(huán)化4.用同一種限制酶切割目的基因和載體在連接過程中可能出現(xiàn)什么問題？思考·討論：重組DNA分子注：選擇限制酶的要求①選目的基因兩端和載體都有的酶切位點(diǎn)，確保出現(xiàn)相同的黏性末端②所選酶切位點(diǎn)不能破壞目的基因和標(biāo)記基因③選擇兩種限制酶的優(yōu)點(diǎn)：防止目的基因和載體自身環(huán)化、反向連接探究·實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，選擇適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法進(jìn)行提取。1、提取DNA的思路：2、提取DNA的原理：①DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。3、鑒定DNA的原理DNA

+二苯胺試劑藍(lán)色沸水浴一、實(shí)驗(yàn)原理：DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等

不能選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯游锍墒斓募t細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA注意：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用探究·實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定1、選材：二、材料用具：2、試劑：探究·實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定探究·實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定三、方法步驟：研磨30g洋蔥（切碎）+10mL研磨液→充分研磨提取上清液方法：①紗布過濾：過濾→4℃冰箱冷藏→取上清液②離心：1500r/min，離心5分鐘→取上清液上清液：除DNA外，還有核蛋白、多糖等雜質(zhì)探究·實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定三、方法步驟：研磨提取上清液析出DNA方案一上清液中+等體積、預(yù)冷的95%酒精溶液

→靜置2～3min

→出現(xiàn)白色絲狀物→用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分方案二離心管

→10000r/min，離心5min→棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干探究·實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定三、方法步驟：研磨提取上清液析出DNADNA的鑒定2mol/LNaCl溶液2mol/LNaCl溶液(加入絲狀物或沉淀物)1.你提取出的白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？觀察提取到的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。

二苯胺試劑鑒定呈藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？本實(shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。四、結(jié)果分析與評價：探究·實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定3.與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因？本實(shí)驗(yàn)可以采取分組的方式進(jìn)行?？梢赃x取不同的實(shí)驗(yàn)材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。四、結(jié)果分析與評價：探究·實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定本實(shí)驗(yàn)只是對DNA進(jìn)行了粗提取，請查閱資料，了解實(shí)驗(yàn)室提取純度較高的DNA的一種方法