關于硝基酪氨酸在2型糖尿病大鼠腎臟的表達及瑞舒伐他汀鈣的影響

關于硝基酪氨酸在2型糖尿病大鼠腎臟的表達及瑞舒伐他汀鈣的影響

【摘要】目的觀察硝基酪氨酸在2型糖尿病模型大鼠腎臟的表達及瑞舒伐他汀鈣(rosuvastatin)對其的影響。方法將大鼠分為正常對照組(C)、糖尿病組(D)、瑞舒伐他汀鈣治療組(N)，比較各組大鼠腎組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和硝基酪氨酸(NT)含量，同時觀察血糖、血胰島素、腎功能和腎臟形態(tài)變化。結果與正常組比較，糖尿病組腎組織中MDA含量明顯上升(P<0.05)，SOD活性顯著下降(P<0.05)，NT增多(P<0.05)，腎功能和腎臟形態(tài)受損，而瑞舒伐他汀鈣治療組的上述表達較糖尿病組明顯改善。結論硝基酪氨酸在糖尿病腎病中的表達明顯增加，而瑞舒伐他汀鈣可以通過抑制氧化應激反應對2型糖尿病模型大鼠腎臟產生保護作用?！娟P鍵詞】硝基酪氨酸;瑞舒伐他汀鈣;糖尿病腎病;氧化應激[Abstract]ObjectiveToevaluatetheexpressionofnitrotyrosineinthekidneytype2diabeticratsandobservetheeffectofRosuvastatinonnitrotyrosine.Methods25ratswerepidedinto3groupsofnormalrats(C)，diabeticrats(D)，diabeticratstreatedwithRosuvastatin(N).Contentofmalonaldehyde(MDA)，activityofantioxidantenzymesincludingsuperoxidedismutase(SOD)andnitrotyrosine(NT)intherenaltissuewerecomparedamongthegroups.Inaddition，bloodglucose，serumcreatinine(Cr)bloodureanitrogen(BUN)weremesured;therenaltissuewereobservedbylightmicroscopyandelectronmicroscopy.ResultsComparedwithnormalgroup，thelevelofBUN，Cr，MDAandNTindiabeticratsweresignificantlyincreased，buttheactivityofSODweredecreasednotably.Inaddition，therenalpathologicdetrimentsignificantlyhigherthannormalcontrols.Butthosewereimprovedinthetreatedgroupobviously.ConclusionOxidativestresstakeanimportantroleinthedevelopmentofdiabeticnephropathy.TheexpressionofNitrotyrosineintype2diabeticratswereincreased.AndantioxidationmaybethepossiblemechanismoftheneohroprotectiveactionofRosuvastatin.[Keywords]nitrotyrosine;rosuvastatin;diabeticnephropathy;oxidarivestress氧化應激主要是通過自由基對體內的DNA、蛋白質和脂肪的氧化修飾導致組織損傷。越來越多的證據表明，糖尿病引起的氧化應激是導致糖尿病慢性并發(fā)癥的最根本原因之一[1]。深入研究糖尿病中的氧化應激，研究和開發(fā)新的抗氧化藥物，將為糖尿病慢性并發(fā)癥的預防和治療提供新的方向和途徑。瑞舒伐他汀鈣上市以來，主要作為降膽固醇及抗動脈粥樣硬化藥。近年來，大量資料及體內外試驗表明，其也有很強的抗氧化作用，而硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)是自由基引起蛋白質損傷產生，可以作為過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-)的特異性標志物，目前有關NT在糖尿病腎臟的表達國內甚少報道。本實驗以2型糖尿病(DM)模型大鼠為研究對象，探索觀察糖尿病大鼠腎組織NT的表達，并進一步觀察瑞舒伐他汀鈣對NT表達以及對其他氧化應激標志物的影響。1材料與儀器1.1實驗動物25只清潔級Wistar大鼠，雄性，購自河南大學動物中心，體重100～150g。1.2試藥鏈尿佐菌素(STZ，德國MERCK公司，以0.1mol/L、pH為4.2的枸櫞酸緩沖液溶解，臨用前配制);瑞舒伐他汀鈣(商品名瑞舒伐他汀鈣，阿斯利康制藥有限公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、硝基酪氨酸檢測試劑盒(美國Cayman公司)。1.3儀器紫外分光光度計(上海分析儀器廠);自動生化分析儀(美國Technicon公司);磁酶聯(lián)免疫測定儀(北京倍愛康生物技術有限責任公司)。2方法2.1動物分組與處理大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為正常對照組(C組，7只)和實驗組(B組，18只)。C組給予普通食料，B組給予高糖、高脂飲食(由常規(guī)飼料加15%蔗糖、5%豬油、0.5%膽固醇配制而成)。4周后B組腹腔注射STZ(注射量為35mg/kg)，72h后經尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)。以禁食后血糖水平≥空白組均數(shù)±3倍標準差為標準，判定2型糖尿病大鼠模型是否建立成功。成功者(共14只)再隨機分為糖尿病組(D組，7只)和糖尿病瑞舒伐他汀鈣治療組(N組，7只)，N組以瑞舒伐他汀鈣500mg/(kg?d)灌胃，C組、D組則給予相同劑量的蒸餾水各組大鼠均單籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水，給藥8周后代謝籠收集24h尿液，低溫離心后測尿微量白蛋白。后麻醉大鼠，自下腔靜脈取血，摘取雙側腎臟，稱重，取部分皮質以4%的多糖甲醛固定，部分以3.7%的戊二醛液固定。2.2檢測項目與方法2.2.1生化指標的檢測血糖水平用葡萄糖氧化酶法檢測，血胰島素水平采用磁酶聯(lián)免疫吸附法檢測，血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)由自動生化分析儀檢測，24h尿微量白蛋白采用放射免疫法測定。2.2.2腎組織勻漿中MDA含量、SOD活性的測定將10%的組織勻漿低溫離心，取上清液，采用化學比色法測定光吸收度，計算MDA、SOD含量。2.2.3腎組織免疫學檢查常規(guī)脫蠟，封閉，一抗37°C孵育2h，4°C冰箱過夜，標記二抗，做免疫染色，應用高清晰度彩色免疫圖像分析系統(tǒng)(IPP55.0)分析，測定腎小球(平均光密度)直徑。2.2.4腎臟組織電鏡觀察腎組織固定，脫水，包埋，切片，染色，在Hitachi-7500透射電鏡下觀察。2.3統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據以±s表示，應用SPSS13統(tǒng)計軟件進行處理，兩組間數(shù)據采用ANOVA檢驗，若方差不齊，采用非參數(shù)統(tǒng)計檢驗，P<0.05為差異有顯著性。3結果3.1各組大鼠血糖、腎功能及病理形態(tài)的變化見表1。表1各組大鼠尿白蛋白、血糖、BUN、Cr的變化3.2正常對照組、糖尿病組、糖尿病瑞舒伐他汀鈣治療組病理改變見圖1。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，D組大鼠GBM明顯增厚，系膜區(qū)增寬，部分腎小球出現(xiàn)硬化，經瑞舒伐他汀鈣治療后，上述病理改變得到改善。3.3正常對照組、糖尿病組、糖尿病瑞舒伐他汀鈣治療組超微結構改變見圖2。圖2正常組(C組)(7000)、糖尿病組(D組)(10000)、糖尿病瑞舒伐他汀鈣治療組(N組)(8000)腎臟超微結構由圖2可見，C組腎小球基底膜結構清晰完整，血管內皮細胞足細胞未見異常。D組基底膜不均勻增厚，內皮細胞排列紊亂，脫落，完整性破壞，足突增粗融合。腎小管上皮腫脹。部分溶酶體內可見空泡變性，線粒體腫脹。N組亦可見上述變性，但程度較D組減輕。3.4各組大鼠腎組織中MDA含量、SOD活性及硝基酪氨酸(NT)的變化見表2、圖3。表2各組大鼠腎組織中MDA含量、SOD活性及NT變化造模8周后，D組腎組織中MDA含量較同期C組明顯升高，而SOD活性則較同期C組下降。經瑞舒伐他汀鈣治療后，N組MDA含量較同期D組明顯下降，S0D活性則較同期D組增加，造模8周后，D組腎組織中硝基酪氨酸(NT)活性較同期C組明顯升高。經瑞舒伐他汀鈣治療后，N組腎組織中硝基酪氨酸(NT)活性較同期D組明顯下降。3.5各氧化應激指標與尿白蛋白和Cr的相關分析見表3。表3MDA、SOD、NT與24h尿微量白蛋白、血Cr相關分析表3表明MDA、NT與24h尿微量白蛋白、血Cr呈明顯的正相關，而SOD與24h尿微量白蛋白、血Cr呈明顯的負相關。4討論DN是致糖尿病終末期發(fā)生腎衰竭的重要原因，其發(fā)病機制及治療方法是目前研究的熱點之一。因2型糖尿病發(fā)病率占DM總發(fā)病率的90%，故以2型糖尿病模型作為研究對象。在本實驗中，成功建立了2型DM的大鼠模型。該模型發(fā)病過程及特征與2型糖尿病的臨床過程和代謝特征類似。本研究發(fā)現(xiàn)，12周后，糖尿病大鼠各種氧化應激指標包括MDA和NT都明顯增高，而抗氧化指標SOD則明顯低于正常對照，說明2型糖尿病大鼠的抗氧化能力明顯下降，氧自由基生成增多，促進了糖尿病的發(fā)生，這與近年的其他研究一致[2，3]。氧化應激是指體內活性氧類生成和抗氧化防御功能之間平衡的紊亂。機體受到外來的刺激，激活細胞質膜上的還原型輔酶Ⅰ(NADPH)氧化復合體發(fā)生呼吸鏈級鏈反應，釋放出大量的ROS。ROS是生物體內有氧代謝過程中產生的活性產物，主要包括氧自由基、過氧化氫、氫氧自由基、單線態(tài)分子氧、過氧化酯類等。其具有一定的毒性。DM時高血糖可激活細胞內蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)信息傳導途徑，PKC在巨噬細胞和非巨噬細胞的還原型煙酰胺酰嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活化過程中起重要作用，而NADPH氧化酶被認為是ROS產生的最重要機制[4]。高糖引起的線粒體內膜電位差增大，形成超極化，通過輔酶Q的電子傳遞鏈使氧分子還原，產生大量的ROS[5]。線粒體電子傳遞鏈復合物的抑制劑可有效抑制高糖引起的大鼠腎系膜細胞和腎小管上皮細胞中ROS的含量也證實了這點[6]。本研究還表明糖尿病的氧化應激與糖尿病腎病的發(fā)生存在密切關系，2型糖尿病大鼠成模12周后，BUN、Cr和ALB升高，DBM增厚，系膜區(qū)明顯增寬，部分腎小球出現(xiàn)硬化，足突成階段性融合，說明高糖狀態(tài)下腎臟功能和形態(tài)均受到損傷。相關分析表明糖尿病大鼠尿白蛋白排量、Cr與NT和MDA呈正相關，與SOD呈負相關，說明氧化應激參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。Chang等發(fā)現(xiàn)局部氧自由基水平與腎小球硬化和系膜增生相關[7]，在糖尿病發(fā)展中起重要作用。因此，抗氧化治療可減輕DM引起的腎臟損傷。NT是自由基引起蛋白質損傷的一個重要標志物，目前認為硝基酪氨酸是ONOO-在體內生成的特異性標志物，能敏感反映ONOO-含量[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病時NT表達明顯增高[9，10]，是腎小球細胞蛋白質氧化應激的指標。本研究發(fā)現(xiàn)成模后的2型糖尿病大鼠腎臟的NT表達明顯高于正常組(P<0.05)，并與24h尿白蛋白排量密切相關，說明氧化應激在糖尿病腎病的發(fā)病機制中起重要作用。本研究通過瑞舒伐他汀鈣抗氧化治療，造模12周后，發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀鈣治療組氧化指標MDA的水平明顯減少，SOD的含量增加，同時使尿白蛋白水平下降，腎臟病理和超微結構都有明顯的好轉，表明其改善了氧化應激狀態(tài)，緩解了腎損傷，保護了腎臟功能。瑞舒伐他汀鈣自上市以來，主要作為降膽固醇及抗動脈硬化藥。近年來，瑞舒伐他汀鈣的強抗氧化作用較其降脂作用更受到人們的關注。研究發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀鈣對體內脂質有較強的