關(guān)于硝基酪氨酸在2型糖尿病大鼠腎臟的表達(dá)及瑞舒伐他汀鈣的影響

關(guān)于硝基酪氨酸在2型糖尿病大鼠腎臟的表達(dá)及瑞舒伐他汀鈣的影響

【摘要】目的觀察硝基酪氨酸在2型糖尿病模型大鼠腎臟的表達(dá)及瑞舒伐他汀鈣(rosuvastatin)對其的影響。方法將大鼠分為正常對照組(C)、糖尿病組(D)、瑞舒伐他汀鈣治療組(N)，比較各組大鼠腎組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和硝基酪氨酸(NT)含量，同時(shí)觀察血糖、血胰島素、腎功能和腎臟形態(tài)變化。結(jié)果與正常組比較，糖尿病組腎組織中MDA含量明顯上升(P<0.05)，SOD活性顯著下降(P<0.05)，NT增多(P<0.05)，腎功能和腎臟形態(tài)受損，而瑞舒伐他汀鈣治療組的上述表達(dá)較糖尿病組明顯改善。結(jié)論硝基酪氨酸在糖尿病腎病中的表達(dá)明顯增加，而瑞舒伐他汀鈣可以通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對2型糖尿病模型大鼠腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】硝基酪氨酸;瑞舒伐他汀鈣;糖尿病腎病;氧化應(yīng)激[Abstract]ObjectiveToevaluatetheexpressionofnitrotyrosineinthekidneytype2diabeticratsandobservetheeffectofRosuvastatinonnitrotyrosine.Methods25ratswerepidedinto3groupsofnormalrats(C)，diabeticrats(D)，diabeticratstreatedwithRosuvastatin(N).Contentofmalonaldehyde(MDA)，activityofantioxidantenzymesincludingsuperoxidedismutase(SOD)andnitrotyrosine(NT)intherenaltissuewerecomparedamongthegroups.Inaddition，bloodglucose，serumcreatinine(Cr)bloodureanitrogen(BUN)weremesured;therenaltissuewereobservedbylightmicroscopyandelectronmicroscopy.ResultsComparedwithnormalgroup，thelevelofBUN，Cr，MDAandNTindiabeticratsweresignificantlyincreased，buttheactivityofSODweredecreasednotably.Inaddition，therenalpathologicdetrimentsignificantlyhigherthannormalcontrols.Butthosewereimprovedinthetreatedgroupobviously.ConclusionOxidativestresstakeanimportantroleinthedevelopmentofdiabeticnephropathy.TheexpressionofNitrotyrosineintype2diabeticratswereincreased.AndantioxidationmaybethepossiblemechanismoftheneohroprotectiveactionofRosuvastatin.[Keywords]nitrotyrosine;rosuvastatin;diabeticnephropathy;oxidarivestress氧化應(yīng)激主要是通過自由基對體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和脂肪的氧化修飾導(dǎo)致組織損傷。越來越多的證據(jù)表明，糖尿病引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥的最根本原因之一[1]。深入研究糖尿病中的氧化應(yīng)激，研究和開發(fā)新的抗氧化藥物，將為糖尿病慢性并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供新的方向和途徑。瑞舒伐他汀鈣上市以來，主要作為降膽固醇及抗動脈粥樣硬化藥。近年來，大量資料及體內(nèi)外試驗(yàn)表明，其也有很強(qiáng)的抗氧化作用，而硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)是自由基引起蛋白質(zhì)損傷產(chǎn)生，可以作為過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-)的特異性標(biāo)志物，目前有關(guān)NT在糖尿病腎臟的表達(dá)國內(nèi)甚少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以2型糖尿病(DM)模型大鼠為研究對象，探索觀察糖尿病大鼠腎組織NT的表達(dá)，并進(jìn)一步觀察瑞舒伐他汀鈣對NT表達(dá)以及對其他氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響。1材料與儀器1.1實(shí)驗(yàn)動物25只清潔級Wistar大鼠，雄性，購自河南大學(xué)動物中心，體重100～150g。1.2試藥鏈尿佐菌素(STZ，德國MERCK公司，以0.1mol/L、pH為4.2的枸櫞酸緩沖液溶解，臨用前配制);瑞舒伐他汀鈣(商品名瑞舒伐他汀鈣，阿斯利康制藥有限公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、硝基酪氨酸檢測試劑盒(美國Cayman公司)。1.3儀器紫外分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);自動生化分析儀(美國Technicon公司);磁酶聯(lián)免疫測定儀(北京倍愛康生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。2方法2.1動物分組與處理大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為正常對照組(C組，7只)和實(shí)驗(yàn)組(B組，18只)。C組給予普通食料，B組給予高糖、高脂飲食(由常規(guī)飼料加15%蔗糖、5%豬油、0.5%膽固醇配制而成)。4周后B組腹腔注射STZ(注射量為35mg/kg)，72h后經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)。以禁食后血糖水平≥空白組均數(shù)±3倍標(biāo)準(zhǔn)差為標(biāo)準(zhǔn)，判定2型糖尿病大鼠模型是否建立成功。成功者(共14只)再隨機(jī)分為糖尿病組(D組，7只)和糖尿病瑞舒伐他汀鈣治療組(N組，7只)，N組以瑞舒伐他汀鈣500mg/(kg?d)灌胃，C組、D組則給予相同劑量的蒸餾水各組大鼠均單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，給藥8周后代謝籠收集24h尿液，低溫離心后測尿微量白蛋白。后麻醉大鼠，自下腔靜脈取血，摘取雙側(cè)腎臟，稱重，取部分皮質(zhì)以4%的多糖甲醛固定，部分以3.7%的戊二醛液固定。2.2檢測項(xiàng)目與方法2.2.1生化指標(biāo)的檢測血糖水平用葡萄糖氧化酶法檢測，血胰島素水平采用磁酶聯(lián)免疫吸附法檢測，血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)由自動生化分析儀檢測，24h尿微量白蛋白采用放射免疫法測定。2.2.2腎組織勻漿中MDA含量、SOD活性的測定將10%的組織勻漿低溫離心，取上清液，采用化學(xué)比色法測定光吸收度，計(jì)算MDA、SOD含量。2.2.3腎組織免疫學(xué)檢查常規(guī)脫蠟，封閉，一抗37°C孵育2h，4°C冰箱過夜，標(biāo)記二抗，做免疫染色，應(yīng)用高清晰度彩色免疫圖像分析系統(tǒng)(IPP55.0)分析，測定腎小球(平均光密度)直徑。2.2.4腎臟組織電鏡觀察腎組織固定，脫水，包埋，切片，染色，在Hitachi-7500透射電鏡下觀察。2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用SPSS13統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，兩組間數(shù)據(jù)采用ANOVA檢驗(yàn)，若方差不齊，采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。3結(jié)果3.1各組大鼠血糖、腎功能及病理形態(tài)的變化見表1。表1各組大鼠尿白蛋白、血糖、BUN、Cr的變化3.2正常對照組、糖尿病組、糖尿病瑞舒伐他汀鈣治療組病理改變見圖1。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，D組大鼠GBM明顯增厚，系膜區(qū)增寬，部分腎小球出現(xiàn)硬化，經(jīng)瑞舒伐他汀鈣治療后，上述病理改變得到改善。3.3正常對照組、糖尿病組、糖尿病瑞舒伐他汀鈣治療組超微結(jié)構(gòu)改變見圖2。圖2正常組(C組)(7000)、糖尿病組(D組)(10000)、糖尿病瑞舒伐他汀鈣治療組(N組)(8000)腎臟超微結(jié)構(gòu)由圖2可見，C組腎小球基底膜結(jié)構(gòu)清晰完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞足細(xì)胞未見異常。D組基底膜不均勻增厚，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，脫落，完整性破壞，足突增粗融合。腎小管上皮腫脹。部分溶酶體內(nèi)可見空泡變性，線粒體腫脹。N組亦可見上述變性，但程度較D組減輕。3.4各組大鼠腎組織中MDA含量、SOD活性及硝基酪氨酸(NT)的變化見表2、圖3。表2各組大鼠腎組織中MDA含量、SOD活性及NT變化造模8周后，D組腎組織中MDA含量較同期C組明顯升高，而SOD活性則較同期C組下降。經(jīng)瑞舒伐他汀鈣治療后，N組MDA含量較同期D組明顯下降，S0D活性則較同期D組增加，造模8周后，D組腎組織中硝基酪氨酸(NT)活性較同期C組明顯升高。經(jīng)瑞舒伐他汀鈣治療后，N組腎組織中硝基酪氨酸(NT)活性較同期D組明顯下降。3.5各氧化應(yīng)激指標(biāo)與尿白蛋白和Cr的相關(guān)分析見表3。表3MDA、SOD、NT與24h尿微量白蛋白、血Cr相關(guān)分析表3表明MDA、NT與24h尿微量白蛋白、血Cr呈明顯的正相關(guān)，而SOD與24h尿微量白蛋白、血Cr呈明顯的負(fù)相關(guān)。4討論DN是致糖尿病終末期發(fā)生腎衰竭的重要原因，其發(fā)病機(jī)制及治療方法是目前研究的熱點(diǎn)之一。因2型糖尿病發(fā)病率占DM總發(fā)病率的90%，故以2型糖尿病模型作為研究對象。在本實(shí)驗(yàn)中，成功建立了2型DM的大鼠模型。該模型發(fā)病過程及特征與2型糖尿病的臨床過程和代謝特征類似。本研究發(fā)現(xiàn)，12周后，糖尿病大鼠各種氧化應(yīng)激指標(biāo)包括MDA和NT都明顯增高，而抗氧化指標(biāo)SOD則明顯低于正常對照，說明2型糖尿病大鼠的抗氧化能力明顯下降，氧自由基生成增多，促進(jìn)了糖尿病的發(fā)生，這與近年的其他研究一致[2，3]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧類生成和抗氧化防御功能之間平衡的紊亂。機(jī)體受到外來的刺激，激活細(xì)胞質(zhì)膜上的還原型輔酶Ⅰ(NADPH)氧化復(fù)合體發(fā)生呼吸鏈級鏈反應(yīng)，釋放出大量的ROS。ROS是生物體內(nèi)有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性產(chǎn)物，主要包括氧自由基、過氧化氫、氫氧自由基、單線態(tài)分子氧、過氧化酯類等。其具有一定的毒性。DM時(shí)高血糖可激活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)信息傳導(dǎo)途徑，PKC在巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞的還原型煙酰胺酰嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活化過程中起重要作用，而NADPH氧化酶被認(rèn)為是ROS產(chǎn)生的最重要機(jī)制[4]。高糖引起的線粒體內(nèi)膜電位差增大，形成超極化，通過輔酶Q的電子傳遞鏈?zhǔn)寡醴肿舆€原，產(chǎn)生大量的ROS[5]。線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物的抑制劑可有效抑制高糖引起的大鼠腎系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中ROS的含量也證實(shí)了這點(diǎn)[6]。本研究還表明糖尿病的氧化應(yīng)激與糖尿病腎病的發(fā)生存在密切關(guān)系，2型糖尿病大鼠成模12周后，BUN、Cr和ALB升高，DBM增厚，系膜區(qū)明顯增寬，部分腎小球出現(xiàn)硬化，足突成階段性融合，說明高糖狀態(tài)下腎臟功能和形態(tài)均受到損傷。相關(guān)分析表明糖尿病大鼠尿白蛋白排量、Cr與NT和MDA呈正相關(guān)，與SOD呈負(fù)相關(guān)，說明氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。Chang等發(fā)現(xiàn)局部氧自由基水平與腎小球硬化和系膜增生相關(guān)[7]，在糖尿病發(fā)展中起重要作用。因此，抗氧化治療可減輕DM引起的腎臟損傷。NT是自由基引起蛋白質(zhì)損傷的一個重要標(biāo)志物，目前認(rèn)為硝基酪氨酸是ONOO-在體內(nèi)生成的特異性標(biāo)志物，能敏感反映ONOO-含量[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病時(shí)NT表達(dá)明顯增高[9，10]，是腎小球細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)成模后的2型糖尿病大鼠腎臟的NT表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)，并與24h尿白蛋白排量密切相關(guān)，說明氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。本研究通過瑞舒伐他汀鈣抗氧化治療，造模12周后，發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀鈣治療組氧化指標(biāo)MDA的水平明顯減少，SOD的含量增加，同時(shí)使尿白蛋白水平下降，腎臟病理和超微結(jié)構(gòu)都有明顯的好轉(zhuǎn)，表明其改善了氧化應(yīng)激狀態(tài)，緩解了腎損傷，保護(hù)了腎臟功能。瑞舒伐他汀鈣自上市以來，主要作為降膽固醇及抗動脈硬化藥。近年來，瑞舒伐他汀鈣的強(qiáng)抗氧化作用較其降脂作用更受到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀鈣對體內(nèi)脂質(zhì)有較強(qiáng)的