1.2微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應用（二）（學生版）

《第1章發(fā)酵工程》第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應用二微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)必會知識考點梳理拓展延伸易錯警示必會知識一選擇培養(yǎng)基1．自然界中目的菌株的篩選(1)原理：根據(jù)目的菌株對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。(2)實例：DNA聚合酶鏈式反應(PCR)中用到的耐高溫的DNA聚合酶。就是從水生棲熱菌中分離出來的。2．實驗室中目的菌株的篩選(1)原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度和pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。(2)方法：利用選擇培養(yǎng)基分離。①選擇培養(yǎng)基：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。②選擇培養(yǎng)基的設計原理：根據(jù)某種微生物對某種營養(yǎng)物質(zhì)的特殊要求或者對某些特殊理化因素的抗性進行設計。(3)典型實例：利用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基分離土壤中分解尿素的細菌。組分KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素瓊脂H2O含量1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g定容至1000mL提供的主要營養(yǎng)和作用無機鹽碳源氮源碳源凝固劑水只有能夠以尿素作為唯一氮源的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長繁殖。必會知識二微生物的選擇培養(yǎng)1．將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。主要操作環(huán)節(jié)：系列稀釋和涂布平板。(1)系列稀釋(梯度稀釋)操作①將分別盛有9mL無菌水的6支試管滅菌，并按1×102～1×107的順序編號。②用移液槍吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入1×102倍稀釋的試管中。槍頭插入液面下吸打幾次，吸打時不用更換槍頭，但是吸取上一級溶液時必須更換新的槍頭。③從1×102倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入1×103倍稀釋的試管中，重復上一步的混勻操作。依次類推，直到完成最后一支試管的稀釋。(2)涂布平板操作必會知識三微生物的數(shù)量測定1．稀釋涂布平板法(活菌計數(shù)法)(1)原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)來推測樣品中大約含有的活菌數(shù)。(2)統(tǒng)計原則①為了獲得菌落數(shù)為30～300、適于計數(shù)的平板，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)；②每個稀釋度至少涂布3個平板，取其平均值(作為重復實驗，統(tǒng)計時取平均值，以減少偶然因素對實驗結(jié)果的影響，增強實驗結(jié)果的可信度)。(3)計算公式：每克樣品中的菌株數(shù)=(C÷V)×M。C：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)；M：稀釋倍數(shù)。(4)結(jié)果分析：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目少。因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)表示。原因分析：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落：除此之外，在操作過程中，一些細菌會死亡，也會造成統(tǒng)計的菌落數(shù)偏低。2．顯微鏡直接計數(shù)法(1)原理：利用血細胞計數(shù)板(細菌計數(shù)板)，在顯微鏡下觀察、計數(shù)、然后再計算一定容體的樣品中微生物的數(shù)量。(2)血細胞計數(shù)板：計數(shù)室有兩種常見方格網(wǎng)，均有400小格，對于16(中)×25(小)的方格網(wǎng)而言，統(tǒng)計四角的4個中方格(共計100個小方格)中的個體數(shù)量；而對于25(中)×16(小)的方格網(wǎng)而言，統(tǒng)計四角和正中間的共5個中方格(共計80個小方格)中的個體數(shù)量，如圖所示。每個大方格的體積為0.1mm3(10﹣4mL)，故1mL培養(yǎng)液中細胞個數(shù)＝(中方格中細胞數(shù)/中方格中小方格數(shù))×400×10×稀釋倍數(shù)＝每小格平均細胞數(shù)×400×10×稀釋倍數(shù)。(3)結(jié)果分析：計數(shù)的結(jié)果比實際值偏大。因為顯微鏡下無法區(qū)分細胞的死活，計數(shù)時包括了死細胞。3．其他方法—濾膜法濾膜法可用來測定飲水中大腸桿菌的數(shù)量。將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅—亞甲藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)深紫色，可以根據(jù)培養(yǎng)基上深紫色菌落的數(shù)目，計算得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。必會知識四土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)實驗1．實驗步驟2．實驗中的無菌操作(1)取土樣的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。(2)應在火焰旁稱取土壤，并在火焰附近將土樣倒入燒瓶中，塞好棉塞。(3)在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。3．制訂計劃：對于耗時較長的生物實驗，要事先規(guī)劃時間，以便提高工作效率，在操作上做到有條不紊。例如：第一天：進行實驗器材的滅菌以及制備培養(yǎng)基的工作；第二天：進行稀釋涂布平板的操作；第三、四、五天：進行實驗結(jié)果的觀察與記錄。4．結(jié)果分析與評價內(nèi)容現(xiàn)象結(jié)論有無雜菌污染的判斷用于對照的空白培養(yǎng)皿中無菌落生長培養(yǎng)基制備過程中未被雜菌污染接種過的培養(yǎng)基中菌落數(shù)偏高，菌種的菌落形態(tài)多樣接種操作等過程中被雜菌污染選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目選擇培養(yǎng)基具有篩選作用樣品的稀釋操作某稀釋度下得到3個或3個以上菌落為30～300的平板操作成功重復組的結(jié)果若選取同一種土樣，統(tǒng)計結(jié)果應接近。若結(jié)果相差太遠，則需要從各項操作過程中去分析、尋找可能的原因5．菌種鑒定(1)原理：細菌合成的脲酶能將尿素分解成氨，使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高。因此，可通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷該化學反應是否發(fā)生。(2)方法：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。6．實驗注意事項(1)做好標記：實驗中使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前要做好標記。標記培養(yǎng)皿時應注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。(2)同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確，需重新進行實驗。(3)在一定的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，菌落的特征包括形狀、大小、隆起程度、顏色等方面。必備技能典例精講模型秒殺巧思妙解必備技能一選擇培養(yǎng)基的[例1](2022春·重慶·高二校聯(lián)考期末)某同學想通過選擇培養(yǎng)基分離以下生物，下列敘述錯誤的是()A．欲篩選硝化細菌，培養(yǎng)基中無需有C源，但必須有N源B．欲篩選分解尿素的細菌，培養(yǎng)基中必須有N源，可以無C源C．欲篩選固氮菌，培養(yǎng)基中必須有C源，可以無N源D．欲篩選分解纖維素的細菌，培養(yǎng)基中必須有C源和N源必備技能二單個的菌落形成[例2](2022春·重慶·高二重慶市育才中學校考周測)下圖中甲是稀釋涂布平板法中的部分操作，乙是平板劃線法的操作結(jié)果。下列敘述中正確的是()A．甲涂布前要將涂布器灼燒，灼燒后直接取菌液B．甲、乙操作都可用于微生物的計數(shù)C．乙中接種環(huán)需要灼燒5次D．乙中連續(xù)劃線的起點是上一次劃線的末端必備技能三酵母菌的純培養(yǎng)[例3](2023·全國·高三專題練習)酵母的蛋白含量高，可用作飼料蛋白，且有些酵母能利用工業(yè)廢甲醇作為碳源進行繁殖，既可減少污染，又可降低成本。研究人員擬從土壤中分離該類酵母并大量培養(yǎng)，操作流程如下圖。下列相關(guān)敘述正確的是(

)(注：25×16型血細胞計數(shù)板，表示計數(shù)室中有25個中格，每個中格又分成16個小格。)A．實驗前需對玻璃器皿、金屬用具和培養(yǎng)基進行干熱滅菌B．只有③過程中使用的培養(yǎng)基需以甲醇作為唯一的碳源C．為了保證結(jié)果準確，對每一個平板的菌落都要進行計數(shù)并取平均值D．將發(fā)酵液稀釋1000倍后，用25×16(1mm×1mm×0．1mm)型血細胞計數(shù)板計數(shù)10個中格中的細胞數(shù)為60個，則發(fā)酵液中每毫升有1．5×10?個細胞必備技能四土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)實驗[例4](2022春·河北石家莊·高二石家莊市第四十一中學?？计谥?關(guān)于“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)”實驗操作的敘述，錯誤的是()A．利用稀釋涂布平板法準確估計菌落數(shù)目的關(guān)鍵是有恰當?shù)南♂尪菳．若要判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設置未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照C．該實驗應采用稀釋涂布平板法D．用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基來培養(yǎng)該細菌必備技能五分離土壤中能水解纖維素的微生物并觀察菌落數(shù)[例5](2022·浙江·模擬預測)剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，但對纖維素水解后形成的纖維二糖和葡萄糖無作用。某同學利用剛果紅配制選擇培養(yǎng)基，分離土壤中能水解纖維素的微生物并觀察菌落數(shù)。下列敘述正確的是(

)A．劃線接種后統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，統(tǒng)計值比活菌實際數(shù)高B．選擇培養(yǎng)基中應以剛果紅作為唯一碳源，并加入瓊脂糖作凝固劑C．培養(yǎng)基進行高壓蒸汽滅菌時，滅菌時間應從電源插上開始計時D．可以把濾紙埋在土壤中，經(jīng)過一段時間后，再從已腐爛的濾紙上篩選目的菌必備技能六微生物的選擇培養(yǎng)在實際生活以及科學研究中的應用[例6](2022秋·安徽安慶·高三校考階段練習)某種物質(zhì)X(一種含有C、H、O、N的有機物)難以降解，會對環(huán)境造成污染，只有某些細菌能降解X。研究人員按照如圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解X的細菌菌株。實驗過程中需要甲、乙兩種培養(yǎng)基，甲的組分為無機鹽、水和X，乙的組分為無機鹽、水、X和Y。下列相關(guān)敘述中錯誤的是()A．甲、乙培養(yǎng)基均屬于選擇培養(yǎng)基，乙培養(yǎng)基組分中的Y物質(zhì)是瓊脂B．步驟⑤的篩選過程中，各培養(yǎng)瓶中的X溶液要有一定的濃度梯度C．若要篩選高效降解X的細菌菌株，甲、乙培養(yǎng)基中X是唯一的碳源D．步驟⑤的篩選過程中，若培養(yǎng)基中的X濃度過高，某菌株對X的降解量可能下降[例7](2022春·天津·高二校聯(lián)考期末)嗜熱菌又稱高溫細菌，是一類生活在火山口及其周圍區(qū)域、溫泉、工廠高溫廢水排放區(qū)等高溫環(huán)境中的微生物。研究者從溫泉中管選高效產(chǎn)生高溫淀粉酶的嗜熱菌，其?選過程如圖1所示。將得到的菌懸液轉(zhuǎn)接于同時含有葡萄糖和淀粉作碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到若干菌落后用碘液作顯色處理，結(jié)果如圖2所示。下列說法錯誤的是(

)A．熱泉的高溫狀態(tài)淘汰了絕大多數(shù)的微生物保留了咾熱菌B．甲、乙試管為液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基能擴大培養(yǎng)水生噬熱桿苗C．丙中噬熱菌數(shù)量迅速增加，培養(yǎng)過程中需保證充足的營養(yǎng)和高溫條件D．圖2中周圍顯藍色的菌落含有所需的嗜熱菌必刷好題基礎(chǔ)演練能力提升巔峰突破1．(2022秋·江蘇鎮(zhèn)江·高三江蘇省鎮(zhèn)江第一中學校聯(lián)考階段練習)幽門螺桿菌具有活性很高的脲酶，調(diào)查幽門螺桿菌感染可采用尿素呼氣試驗，用幽門螺桿菌的數(shù)量表示感染情況?，F(xiàn)從待測人員體內(nèi)采集樣本并制成菌液后，按如下步驟進行分離培養(yǎng)，下列敘述正確的是(

)A．滅菌之前應先將平板的pH調(diào)節(jié)至中性或弱酸性B．圖中X步驟可以使用平板劃線法或稀釋涂布平板法C．目的菌接種到培養(yǎng)基后應立即將倒置的平板放入30~37℃恒溫箱中D．培養(yǎng)基中加入的酚紅指示劑使平板上有的菌落周圍出現(xiàn)紅色透明圈2．(2021秋·山西運城·高三?？奸_學考試)平板劃線法和稀釋涂布平板法是常用的兩種接種方法。下列相關(guān)敘述中錯誤的是()A．平板劃線法要求在培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線，且除第一次劃線外，每一次劃線的起點都是上一次劃線的終點B．除第一次劃線前需要將接種環(huán)灼燒滅菌外，以后的劃線可以不用滅菌C．如果菌液本來濃度不高，則可以適當降低稀釋倍數(shù)D．“充分稀釋”和“連續(xù)劃線”的目的都是獲得由單一細胞繁殖而成的菌落3．(2022春·青海西寧·高二校聯(lián)考期末)以下關(guān)于能分解尿素的細菌的說法，正確的是()A．能分解尿素的原因是能合成蛋白酶B．用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌后不會使酚紅指示劑變紅C．環(huán)境中含有大量的尿素誘導該細菌產(chǎn)生了分解尿素的特性D．分離該種細菌時以尿素作為唯一碳源4．(2022春·四川·高二期中)在“分離土壤中分解尿素的細菌”實驗中，為判斷是否起到了分離效果，提高實驗結(jié)果的可信度，需要精心設置對照。對照組的設置方式為()A．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種相同土壤樣液B．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種無菌水C．篩選分解尿素細菌的選擇培養(yǎng)基不接種D．篩選分解尿素細菌的選擇培養(yǎng)基上接種無菌水5．(2022春·四川雅安·高二校考期中)下列關(guān)于纖維素分解菌分離實驗的說法不正確的是()A．通常采用剛果紅染色法篩選纖維素分解菌B．從土壤中分離含量較多的微生物時，選擇培養(yǎng)可以省略C．該實驗用到的是鑒別培養(yǎng)基D．要從土壤中將分解纖維素的細菌分離出來，應該將它們接種在只有纖維素粉而無其他碳源的選擇培養(yǎng)基上6．(2022·四川綿陽·鹽亭中學?？家荒?利用微生物分解纖維素對廢棄物污染的減輕和作物秸稈再利用具有重要意義。某興趣小組從富含纖維素的土壤中取樣，加入選擇培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，之后接種于鑒別培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，篩選出能夠分解纖維素的微生物。下列敘述錯誤的是()A．選擇培養(yǎng)的目的是促進纖維素分解菌生長，抑制其他微生物的生長B．振蕩培養(yǎng)可以增加溶解氧量，促進微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和利用C．鑒別培養(yǎng)基上涂布接種時，將1mL菌液滴到培養(yǎng)基表面再用涂布器涂布均勻D．加入剛果紅的鑒別培養(yǎng)基上出現(xiàn)透明圈的菌落，可能是能夠分解纖維素的微生物7．(2023·全國·高三專題練習)某生物興趣小組把從固體培養(yǎng)基上分離出來的野生酵母菌接種到盛有等量同種液體培養(yǎng)基的三個相同錐形瓶中，并分別放在轉(zhuǎn)速為2l0r/min、230r/min、250r/min的搖床上培養(yǎng)，得到如圖所示結(jié)果，下列有關(guān)分析錯誤的是(

)A．在固體培養(yǎng)基上分離所需菌種可以使用平板劃線法B．用血細胞計數(shù)板對培養(yǎng)液中酵母菌直接計數(shù)時，數(shù)值會偏小C．在不同培養(yǎng)條件下相同錐形瓶內(nèi)酵母菌種群的最大數(shù)量不同D．實驗結(jié)果出現(xiàn)不同的原因與培養(yǎng)過程中氧氣的供應量有關(guān)8．(2022春·河北滄州·高二任丘市第一中學校考期末)丙草胺是一種應用廣泛的除草劑，能抑制土壤細菌、放線菌和真菌的生長。某生物興趣小組從達活泉公園土壤中分離出能有效降解丙草胺的細菌菌株，并對其進行計數(shù)(如下圖所示)，以期為修復被丙草胺污染土壤提供微生物資源。下列有關(guān)敘述錯誤的是(

)A．將培養(yǎng)基pH調(diào)至酸性，有利于丙草胺降解菌的生長繁殖B．除了用圖中所示計數(shù)方法之外，還可用顯微鏡直接計數(shù)法，其計數(shù)結(jié)果往往比實際值偏大C．用以丙草胺為唯一氮源的液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)可提高丙草胺降解菌濃度D．通過計算得知每克土壤中的菌株數(shù)約為1.7×109個40．(2022秋·山東青島·高三山東省青島第十七中學校考期中)自生固氮菌是土壤中能獨立固定空氣中N2的細菌，將玉米種子用自生固氮菌拌種后播種，可顯著提高產(chǎn)量并降低化肥的使用量?？蒲腥藛T進行了土壤中自生固氮菌的分離和固氮能力測定的研究，部分實驗流程如下圖?；卮鹣铝袉栴}：(1)下表為兩種培養(yǎng)基的配方，步驟④應選其中的__________________________培養(yǎng)基，原因是__________________________________________。培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基組分Ashby培養(yǎng)基甘露醇(C6H14O6)、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCI、K2SO4、CaCO3、蒸餾水、瓊脂LB培養(yǎng)基蛋白豚、酵母提取物、NaCI、蒸餾水、瓊脂(2)步驟④所用的接種工具是_______________，若在④的平板上統(tǒng)計的菌落的平均數(shù)量為126個，則每克土壤中含有的固氮菌為_____________個。(3)將純化的固氮菌置于完全培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)48小時，經(jīng)離心后收集下層細胞并轉(zhuǎn)移至特定培養(yǎng)基中進行固氮能力的測定，篩選出固氮能力最強的菌種CM12，為進一步鑒定其固氮能力，科研人員選用發(fā)芽一致的玉米種子進行3組盆栽實驗，30天后測定土壤微生物有機氮含量，結(jié)果如下圖。注：CK：對照處理組；N：尿素處理組(每盆土壤中50mI有氮全營養(yǎng)液：成分為在1000mL無氮植物營養(yǎng)液中加入0.12g尿素)；CM12：自生固氮菌CM12處理組(每盆土壤澆50mL，接種自身固氮菌的無氮植物營養(yǎng)液)。①對照組(CK)的處理為__________________________。