血清球蛋白的分離純化實(shí)驗(yàn)六

關(guān)于血清球蛋白的分離純化實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)原理1.了解并初步掌握鹽析法分離、純化蛋白質(zhì)的原理。2.熟悉鹽析法分離、純化蛋白質(zhì)的方法。

第2頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理（一）蛋白質(zhì)鹽析在水溶液中，蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和同性電荷層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，因此蛋白質(zhì)在水溶液中比較穩(wěn)定而不易沉淀。

當(dāng)加入較高濃度的中性鹽時(shí)，這些鹽類(lèi)與水有親和性，與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分，破壞蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜。同時(shí)，由于這些鹽是強(qiáng)電解質(zhì)，離子濃度相對(duì)的比較高，可以大量中和蛋白質(zhì)顆粒上的電荷，這樣使蛋白質(zhì)成了既不含水膜又不帶電荷的不穩(wěn)定顆粒而容易沉淀，這就是利用鹽析沉淀蛋白質(zhì)的基本原理。第3頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天由于血清中各種蛋白質(zhì)所帶電荷多少、顆粒大小及親水程度都不一樣，因此使用某種中性鹽進(jìn)行鹽析時(shí)，所需要的鹽濃度也各不相同。50%飽和度的硫酸銨能使血清中的球蛋白沉淀，而33％飽和度的硫酸銨則使γ-球蛋白沉淀?？筛鶕?jù)所要分離的蛋白質(zhì)，選擇不同飽和度的硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析。

第4頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）濃縮

一般實(shí)驗(yàn)室常用的是透析袋（半透膜）濃縮。半透膜具有選擇透過(guò)性，只允許離子和小分子擴(kuò)散進(jìn)出，生物大分子（蛋白質(zhì)等）不能自由通過(guò)半透膜。將待濃縮的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋內(nèi)，用繩子扎緊，然后置于燒杯中。第5頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)試劑與器材試劑：(1)小牛血清

(2)PBS（pH7.2磷酸鹽緩沖生理鹽水）

(3)3%BaCl2溶液

(4)pH7.2飽和硫酸胺溶液器材：(1)離心管

(2)離心機(jī)

(3)移液管

(4)透析袋

第6頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟（一）鹽析——中性鹽沉淀離心管加入血清2ml+2mlPBS

搖勻逐滴加入pH7.2飽和硫酸胺溶液7ml邊加邊搖靜置10min離心（3000轉(zhuǎn)/分）10min棄上清液沉淀+1.0mlPBS使之溶解逐滴加飽和硫酸胺1.5ml搖勻靜置10min離心（3000轉(zhuǎn)/分）10min棄上清液沉淀（γ－球蛋白）第7頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天第9頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）濃縮將上述收集的蛋白質(zhì)+1mlPBS，沉淀完全溶解后，放入透析袋內(nèi)，用繩子扎緊，然后置于100ml燒杯中，加入純凈水。3~5min后，取1ml燒杯中溶液至試管中，再滴加BaCl2若出現(xiàn)白色混濁，將燒杯中的水倒掉，再換上純凈水。直至滴加BaCl2溶液不再出現(xiàn)白色混濁為止。

第10頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)1.在鹽析時(shí)，飽和硫酸銨應(yīng)逐滴加入，速度不能過(guò)快，一定要邊滴加邊攪拌，以減少局部高濃度硫酸銨所引起的共沉現(xiàn)象，攪拌速度不宜過(guò)快，以免產(chǎn)生過(guò)多泡沫，致使蛋白質(zhì)變性。2.硫酸銨濃度越高越容易沉淀。但濃度過(guò)高容易引起其他雜蛋白的共沉作用，因此必須根據(jù)分離蛋白的濃度要求，控制適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度。3.離心時(shí)應(yīng)平衡放置離心管。

4.濃縮時(shí)，滴加BaCl2前，先取出透析袋再滴加。5.更換蒸餾水的目的，是為了增大半透膜兩邊