細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)

關(guān)于細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡:以可見光為光源電子顯微鏡:以電子束為光源第2頁,共94頁，2024年2月25日，星期天一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（一）普通光學(xué)顯微鏡1.結(jié)構(gòu):①照明系統(tǒng):光源和聚光器②光學(xué)放大系統(tǒng):物鏡和目鏡③機(jī)械裝置:用于固定材料和觀察方便第3頁,共94頁，2024年2月25日，星期天雙筒顯微鏡第4頁,共94頁，2024年2月25日，星期天單筒顯微鏡第5頁,共94頁，2024年2月25日，星期天2.原理:經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像,再經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。第6頁,共94頁，2024年2月25日，星期天3.幾個(gè)概念:①放大(率)倍數(shù):顯微鏡最后形成的物體放大像與被檢物體的大小比例,即像高比物高。②分辨力(resolvingpower):指顯微鏡（或人的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體最小間隔的能力。③數(shù)值孔徑(鏡口率)（NumericAperture）：NA=ｎsin(α/2)第7頁,共94頁，2024年2月25日，星期天光學(xué)顯微鏡的分辨力R=0.61λ/N.A．其中λ為入射光線波長(zhǎng)；N.A．為鏡口率

＝ｎsin(α/2)；n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角）。第8頁,共94頁，2024年2月25日，星期天表一、幾種介質(zhì)的折射率第9頁,共94頁，2024年2月25日，星期天4.顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。鏡口角總是要小于180，所以sin(a/2)的最大值必然小于1對(duì)于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長(zhǎng)為400~700nm，因此普通顯微鏡的最大分辨率數(shù)值不會(huì)小于0.2μm，人眼的分辨力是200μm，所以一般顯微鏡設(shè)計(jì)的最大放大倍數(shù)通常為1000倍。第10頁,共94頁，2024年2月25日，星期天(二)相差顯微鏡(phase-contrastmicroscope,PCM)

由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度）的差別。P31在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：1.環(huán)形光闌（annulardiaphragm）位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2.相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ

第11頁,共94頁，2024年2月25日，星期天環(huán)狀光闌裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體——相襯聚光鏡。它是由大小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤內(nèi)，外面標(biāo)有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對(duì)應(yīng)倍數(shù)的物鏡配合使用。第12頁,共94頁，2024年2月25日，星期天原理圖:第13頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共94頁，2024年2月25日，星期天微分干涉顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）當(dāng)兩束光通過光學(xué)系統(tǒng)時(shí)會(huì)發(fā)生相互干涉，如果相位相同，干涉的結(jié)果是亮度增強(qiáng)，反之，就會(huì)相互抵消變暗，這就是光波的干涉現(xiàn)象。微分干涉顯微鏡是以平面偏振光為光源，光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時(shí)間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從而樣品中厚度上的微小差別就會(huì)轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差，造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。微分干涉顯微鏡適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器，如果接上錄像裝置可以記錄活細(xì)胞中的顆粒以及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。第15頁,共94頁，2024年2月25日，星期天(三)熒光顯微鏡技術(shù)(Fluorescencemicroscope)

1.熒光顯微鏡的特點(diǎn):①光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡

第16頁,共94頁，2024年2月25日，星期天②照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上③有兩個(gè)特殊的濾光片，激發(fā)光濾片用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的阻斷濾片用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目第17頁,共94頁，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、DNA藍(lán)色）熒光標(biāo)記:同一樣品可以同時(shí)用兩種以上的熒光素標(biāo)記第18頁,共94頁，2024年2月25日，星期天（四）、激光掃描共焦顯微境第19頁,共94頁，2024年2月25日，星期天激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖第20頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共94頁，2024年2月25日，星期天激光掃描共焦顯微鏡的特點(diǎn):用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)分辨率大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍用途類似熒光顯微鏡,但能掃描不同層次,形成立體圖像掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)第22頁,共94頁，2024年2月25日，星期天LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管第23頁,共94頁，2024年2月25日，星期天(五)暗視野顯微鏡光路圖聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，物體邊緣是亮的。可觀察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。第24頁,共94頁，2024年2月25日，星期天(六)倒置顯微鏡第25頁,共94頁，2024年2月25日，星期天倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。

第26頁,共94頁，2024年2月25日，星期天二、電子顯微鏡技術(shù)(electronmicroscope)（一）、透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM）

1932年Ruska發(fā)明第27頁,共94頁，2024年2月25日，星期天原理:(電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理基本一樣)

用電子束作光源，用電磁場(chǎng)作透鏡,電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長(zhǎng)越短.分辨率0.2nm,放大倍數(shù)為數(shù)百萬倍.用于觀察超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure),及小于0.2μm,光鏡下無法看清的結(jié)構(gòu).第28頁,共94頁，2024年2月25日，星期天光鏡與電子顯微鏡(透射電鏡)的結(jié)構(gòu)第29頁,共94頁，2024年2月25日，星期天3.制樣技術(shù):1）超薄切片技術(shù):步驟:P36電子束穿透力很弱,超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。第30頁,共94頁，2024年2月25日，星期天萊卡超薄切片機(jī)第31頁,共94頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖第32頁,共94頁，2024年2月25日，星期天2）負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria第33頁,共94頁，2024年2月25日，星期天3）冰凍蝕刻(freeze-etching):

標(biāo)本置于-100度的干冰或-196度的液氮中，進(jìn)行快速冰凍。用冷刀驟然將標(biāo)本斷開升溫，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)-蝕刻向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強(qiáng)反差和強(qiáng)度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。

第34頁,共94頁，2024年2月25日，星期天冰凍斷裂與冰凍蝕刻技術(shù)第35頁,共94頁，2024年2月25日，星期天（二）、掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope，SEM)20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu).第36頁,共94頁，2024年2月25日，星期天用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。第37頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共94頁，2024年2月25日，星期天（三）、掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）

由Binnig等1981年發(fā)明,是一種探測(cè)微觀世界物質(zhì)表面形貌的儀器.根據(jù)量子力學(xué)原理中的隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)。當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間產(chǎn)生隧道效應(yīng)而有電子逸出，形成隧道電流。電流強(qiáng)度和針尖與樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，當(dāng)探針沿物質(zhì)表面按給定高度掃描時(shí)，因樣品表面原子凹凸不平，使探針與物質(zhì)表面間的距離不斷發(fā)生改變，從而引起電流不斷發(fā)生改變。將電流的這種改變圖像化即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。第39頁,共94頁，2024年2月25日，星期天利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等分子的原子布陣，和某些生物結(jié)構(gòu)，如生物膜、細(xì)胞壁等的原子排列。分辨率很高，橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm優(yōu)點(diǎn)是三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察，而普通電鏡只能觀察制作好的固體標(biāo)本。第40頁,共94頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、離心技術(shù)(一)、細(xì)胞破碎:(二）、差速離心（differentialcentrifugation）在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。通過差速離心可將細(xì)胞器初步分離

第41頁,共94頁，2024年2月25日，星期天速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀第42頁,共94頁，2024年2月25日，星期天（三）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）：

1、速度沉降（velocitysedimentation）:用途:用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器特點(diǎn):介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度原理:介質(zhì)密度梯度十分平緩,生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離第43頁,共94頁，2024年2月25日，星期天2、等密度沉降（isopycnicsedimentation）:用途:用于分離密度不等的顆粒特點(diǎn):介質(zhì)密度較高,陡度大,介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度;所需要的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心原理:細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力或足夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離

第44頁,共94頁，2024年2月25日，星期天二、細(xì)胞化學(xué)（cytochemistry）技術(shù)——細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的顯示方法P40福爾根(Feulgen)反應(yīng):特異顯示DNA的分布,酸水解-與希夫(Schiff)試劑反應(yīng)-呈紅色第45頁,共94頁，2024年2月25日，星期天FeulgenReaction第46頁,共94頁，2024年2月25日，星期天PAS反應(yīng):顯示多糖的存在利用希夫(Schiff)試劑

糖原由D-葡萄糖的分支或直鏈組成，過碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，能將葡萄糖中乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成二個(gè)游離醛基（—CHO），游離醛基與Schiff‘s試劑反應(yīng)生成紫紅色產(chǎn)物，顏色深淺與多糖含量成正比。第47頁,共94頁，2024年2月25日，星期天（二）其它顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。格莫瑞方法（P40）Schiff反應(yīng)：醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色（深紅色）。米倫反應(yīng)：氮汞試劑與蛋白質(zhì)上的酪氨酸殘基反應(yīng)，形成紅色沉淀，顯示蛋白質(zhì)的存在。（P40）第48頁,共94頁，2024年2月25日，星期天三、免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）——特異蛋白抗原的定位與定性研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子定位的重要技術(shù)。應(yīng)用免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。(一)免疫熒光技術(shù)（immunofluorescenttechnique）P41熒光素:異硫氰酸熒光素（fluoreceinisothiocyante，F(xiàn)ITC），為黃色、橙黃色或褐黃色結(jié)晶粉末，有兩種異構(gòu)體，易溶于水和酒精等溶劑。分子量為389，最大吸收光譜為490～495，最大發(fā)射光譜為520～530urn，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，是最常用的標(biāo)記抗體的熒光素。免疫酶標(biāo)技術(shù):辣根過氧化物酶第49頁,共94頁，2024年2月25日，星期天(二)免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù):金膠體顆粒氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒。

第50頁,共94頁，2024年2月25日，星期天四、細(xì)胞內(nèi)外特異核酸序列的定位與定性——分子雜交（molecularhybridization）可用來測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系（一）、原位雜交（insituhybridization）概念（p41)：細(xì)胞內(nèi)特異核酸（DNAorRNA)序列的定性和定位。用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特意核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中位置的方法。1.光鏡原位雜交：熒光素、放射性同位素2.電鏡原位雜交：生物素、金膠體顆粒第51頁,共94頁，2024年2月25日，星期天

（二）、Southern雜交

原理是，具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。第52頁,共94頁，2024年2月25日，星期天是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。第53頁,共94頁，2024年2月25日，星期天五、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)（一）、流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flowcytometer）第54頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共94頁，2024年2月25日，星期天（二）、顯微光譜分析技術(shù)—顯微分光光度測(cè)定技術(shù)原理：利用細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜的特性，測(cè)定細(xì)胞中某些物質(zhì)的含量。

DNA：含量=50A*稀釋倍數(shù)

公式中50的含義是：在標(biāo)準(zhǔn)厚度為1cm的比色杯中，OD260為1相當(dāng)于50mg/mL的雙鏈DNA，40mg/mL的RNA。紫外光顯微分光光度測(cè)定法：可見光顯微分光光度測(cè)定法：第56頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）:選用最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。第57頁,共94頁，2024年2月25日，星期天人的（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)

1.原代細(xì)胞:2.傳代細(xì)胞:3.細(xì)胞貼壁:4.接觸抑制:第58頁,共94頁，2024年2月25日，星期天5.細(xì)胞系(cellline)：原代細(xì)胞度過傳代危機(jī)又能進(jìn)行傳代的細(xì)胞。有限細(xì)胞系、永生細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)室常見的細(xì)胞系第59頁,共94頁，2024年2月25日，星期天

6.轉(zhuǎn)化細(xì)胞:正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而成為具有癌性的細(xì)胞。

7.細(xì)胞克?。簭哪骋患?xì)胞系中分離出單個(gè)細(xì)胞，由此增殖形成（通過有絲分裂）的具有相同遺傳性狀的細(xì)胞群。

8.細(xì)胞株(cellstrain):經(jīng)過篩選具有特殊的遺傳標(biāo)記或性質(zhì)的細(xì)胞克隆。

第60頁,共94頁，2024年2月25日，星期天（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)1.組織培養(yǎng)：2.單倍體培養(yǎng)：3.原生質(zhì)體培養(yǎng):原生質(zhì)體（protoplast）

第61頁,共94頁，2024年2月25日，星期天植物組織培養(yǎng)

第62頁,共94頁，2024年2月25日，星期天植物原生質(zhì)體培養(yǎng)

第63頁,共94頁，2024年2月25日，星期天(三)非細(xì)胞體系在細(xì)胞生物學(xué)研究中的作用非細(xì)胞體系(cell-freesystem):

來源于細(xì)胞，而不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但包含了進(jìn)行正常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)（如供能系統(tǒng)和酶反應(yīng)體系等）組成的體系即為非細(xì)胞體系。近年來，人們利用這一體系探討了許多細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要問題，如DNA復(fù)制，RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，膜泡運(yùn)輸，細(xì)胞周期調(diào)控、核膜及染色質(zhì)的組裝、核質(zhì)運(yùn)輸機(jī)制等。第64頁,共94頁，2024年2月25日，星期天二、細(xì)胞工程(cellengineering)(一)細(xì)胞融合（cellfusion）P44概念:細(xì)胞雜交（cellhybridization）同核體（homokaryon）

異核體（heterokaryon）誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法:

生物方法:

化學(xué)方法:

物理方法:第65頁,共94頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞融合

第66頁,共94頁，2024年2月25日，星期天（二）、單克隆抗體技術(shù)克?。╟lone）：對(duì)細(xì)胞來說，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。1.血清抗體:抗原免疫系統(tǒng)（B淋巴細(xì)胞）抗體（混合物,抗血清)2.單克隆抗體:單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體（單一物質(zhì))專一性

B淋巴細(xì)胞：體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞：體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體

第67頁,共94頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)模化培養(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡

無限生長(zhǎng)細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長(zhǎng)期存活下來BALB/c雜交瘤技術(shù)操作流程圖解第68頁,共94頁，2024年2月25日，星期天接受抗原刺激后，能分泌針對(duì)該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡——短命細(xì)胞1.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：B淋巴細(xì)胞(Blymphocytes)：雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第69頁,共94頁，2024年2月25日，星期天骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活——長(zhǎng)命細(xì)胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞株——沒有抗體分泌物。第70頁,共94頁，2024年2月25日，星期天2.細(xì)胞融合技術(shù)：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長(zhǎng)命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第71頁,共94頁，2024年2月25日，星期天3.雜交瘤細(xì)胞的篩選：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/

脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/

骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長(zhǎng)期存活不能長(zhǎng)期存活第72頁,共94頁，2024年2月25日，星期天H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)

谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)

(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)HAT培養(yǎng)基篩選第73頁,共94頁，2024年2月25日，星期天(二)細(xì)胞拆合概念:P44

胞質(zhì)體核體細(xì)胞拆合方法:

化學(xué)方法:

物理方法:(三)顯微操作技術(shù)（micromanipulationtechnique）概念:p45顯微操作裝置——用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置應(yīng)用：顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等第74頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第75頁,共94頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞核移植克隆綿羊

第76頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化熒光漂白恢復(fù)技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)放射自顯影技術(shù)第77頁,共94頁，2024年2月25日，星期天一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)概念：P45原理：將待測(cè)細(xì)胞用熒光物質(zhì)標(biāo)記，借助高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞的某一區(qū)域，可以造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅；通過低強(qiáng)度激光掃描成像，可以探測(cè)到該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子向受照射區(qū)域擴(kuò)散的速率。由于光淬滅過程是不可逆的，熒光恢復(fù)過程可明顯的反映熒光標(biāo)記物質(zhì)及其結(jié)合物的運(yùn)動(dòng)。第78頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第79頁,共94頁，2024年2月25日，星期天二、單分子技術(shù)與細(xì)胞生命活動(dòng)概念：在單分子水平上對(duì)生物大分子的行為（包括構(gòu)象變化、相互作用、相互識(shí)別等）進(jìn)行實(shí)時(shí)﹑動(dòng)態(tài)檢測(cè)以及在此基礎(chǔ)上的操縱﹑調(diào)控等。主要的研究手段有兩種：1）單分子光譜學(xué)（熒光、共振能量轉(zhuǎn)移等）2）單分子操縱（光鑷、磁鑷等）第80頁,共94頁，2024年2月25日，星期天三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）用來檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白分子是否直接相互作用的重要手段第81頁,共94頁，2024年2月25日，星期天四、酵母雙雜交技術(shù)它是一種利用單細(xì)胞真核生物酵母在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。1989年由Fields等最先建立的，目前已得到廣泛應(yīng)用。與其他技術(shù)相比，它省去了耗時(shí)耗力的蛋白表達(dá)純化以及抗體制備步驟，并且可以用于高通量的篩選，因此以其簡(jiǎn)便、快捷與廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)迅速發(fā)展成為一種常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。第82頁,共94頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)告基因的表達(dá)來探測(cè)蛋白-蛋白的相互作用。由含有DNA結(jié)合域（DB)和DNA轉(zhuǎn)錄激活域(AD)的轉(zhuǎn)錄激活因子以及酵母報(bào)告株構(gòu)成。分別制備DB與誘餌蛋白質(zhì)A的融合蛋白,

AD與獵物蛋白B的融合蛋白,如果蛋白A與蛋白B在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合，則可形成與轉(zhuǎn)錄激活子類似的具有DB和Ad結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物，從而啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)第83頁,共94頁，2024年2月25日，星期天第84頁,共94頁，2024年2月25日，星期天五、放射自顯影技術(shù)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量。步驟:1