核酸序列分析

關(guān)于核酸序列分析一、分子質(zhì)量、堿基組成、堿基分布二、序列變換三、限制性酶切分析第一節(jié)核酸序列的基本分析（DNAMAN軟件的應(yīng)用）第2頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、核酸測(cè)序中載體序列的識(shí)別與去除1、利用NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)許多數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了常用的測(cè)序載體序列。如果用戶面對(duì)的是大批量序列的分析任務(wù)，則需要將這些載體數(shù)據(jù)庫(kù)下載后進(jìn)行分析。使用Blast程序?qū)Υ祟悢?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性分析即可得知目的序列中是否含有載體序列。（/VecScreen/VecScreen.html)。如果是，那么在對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析之前必須將載體序列去除。(Example)第二節(jié)核酸序列高級(jí)分析（數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件的使用）第3頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、利用SequencherTM軟件美國(guó)基因編碼公司（GeneCodesCorp.)所開發(fā)的SequencherTM軟件在識(shí)別載體序列方面具有很強(qiáng)的功能。SequencherTM軟件被多個(gè)公司用于測(cè)序數(shù)據(jù)的分析和管理。該公司同時(shí)提供該軟件的演示版，可通過(guò)訪問(wèn)其網(wǎng)址獲得（/home.html）。第4頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第5頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第6頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第7頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第9頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、其他人工序列的分析與去除

測(cè)序克隆中往往也含有來(lái)自于宿主菌核酸序列的污染，或者目的克隆的確來(lái)自于該宿主菌。這兩種情況均可通過(guò)BlastN軟件直接對(duì)GenBank或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性分析進(jìn)行判斷。顯然任何與大腸桿菌和釀酒酵母的序列具有高度一致性的序列必須慎重對(duì)待。一些生物如大腸桿菌含有可移動(dòng)的遺傳物質(zhì)如插入序列。在進(jìn)行克隆構(gòu)建以便測(cè)序的過(guò)程中，這些序列有時(shí)會(huì)插入到所構(gòu)建的克隆，導(dǎo)致目的序列測(cè)序的干擾。BlastN程序可以很方便地鑒定此類結(jié)果。如果是這樣的話，此類序列則值得懷疑。第10頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、核酸序列的電子延伸1、簡(jiǎn)介隨著人類基因組計(jì)劃的深入進(jìn)行，很多實(shí)驗(yàn)室采用cDNA文庫(kù)大規(guī)模測(cè)序的策略獲得了大量表達(dá)序列標(biāo)簽（expressedsequencetag,EST）和較長(zhǎng)的cDNA序列。然而在大多數(shù)情況下，人們只能獲得EST序列或較長(zhǎng)的cDNA序列。全長(zhǎng)cDNA序列的獲得一直是制約新基因發(fā)現(xiàn)的瓶頸。第11頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天同時(shí)，很多實(shí)驗(yàn)室采用差異顯示PCR（differentdisplayPCR,DD-PCR）、代表性差異分析（representationaldifferenceanalysis,RDA）等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了大量具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新基因片段，也同時(shí)面臨著全長(zhǎng)cDNA序列難以獲得的問(wèn)題。在實(shí)驗(yàn)方面，或者通過(guò)篩選cDNA文庫(kù)，或者通過(guò)RACE實(shí)驗(yàn)等去獲得新基因的全長(zhǎng)cDNA序列，均需要投入較大的精力。第12頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天而在另一方面，公共數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank/EMBL已經(jīng)擁有了大量的表達(dá)序列標(biāo)簽（/dbEST）。這些EST序列在很多時(shí)候和研究者所感興趣的基因序列相重疊，可能代表了同一條cDNA序列。因而，從生物信息學(xué)的原理出發(fā)，基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列或者較長(zhǎng)cDNA序列對(duì)新獲得的EST序列進(jìn)行電子延伸，就成為很多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。第13頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天這一方案實(shí)際上來(lái)自于最初的克隆測(cè)序過(guò)程。例如，在對(duì)一個(gè)長(zhǎng)為1.5kb的序列進(jìn)行測(cè)序過(guò)程中，如果每次測(cè)序只能獲得500bp的有效序列，則至少需進(jìn)行4次測(cè)序，而且所有測(cè)序結(jié)果的末端必須相互重疊，以便根據(jù)末端重疊序列將該4次測(cè)序所獲得的序列片段進(jìn)行組裝，才能獲得全長(zhǎng)序列。1500kb500kb500kb500kb500kb第14頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、基本過(guò)程（1）將待分析的核酸序列（稱為種子序列）采用Blast軟件搜索GenBank的EST數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇與種子序列具有較高同源性的EST序列（一般要求在重疊40個(gè)堿基范圍內(nèi)有95%以上有同源性）（稱為匹配序列）（2）將匹配序列和種子序列裝配產(chǎn)生新生序列，此過(guò)程稱為片段重疊群分析（contiganalysis）（3）然后再以此新生序列作為種子序列重復(fù)上述過(guò)程，直至沒(méi)有新的匹配序列入選，從而生成最后的新生序列，作為對(duì)種子序列的延伸產(chǎn)物。第15頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、利用UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子延伸利用blastn程序，選擇數(shù)據(jù)庫(kù)“EST”進(jìn)行序列同源性檢索。選擇同源性比分最高的一條EST序列，點(diǎn)擊右邊的UniGene超鏈接，將參與形成UniGeneCluster的所有核酸序列下載到本地，利用SequencherTM軟件或者其他的序列裝配軟件進(jìn)行組裝，形成較長(zhǎng)的新生序列。第16頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第17頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第18頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第19頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第20頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、存在的不足無(wú)法直接通過(guò)此種方法獲得多種剪切形式之間的差異，真正的cDNA序列還需通過(guò)對(duì)延伸后的序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）即可證實(shí)是否對(duì)原序列的有效延伸。第22頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、基因的電子表達(dá)譜分析GenBank/EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)在其EST數(shù)據(jù)庫(kù)中積累了大量序列的基因表達(dá)信息。電子表達(dá)譜分析原理是：將待分析序列與EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列對(duì)庫(kù)檢索，獲得與待分析核酸序列具有高同源性的EST序列的UniGene編號(hào)后，就可通過(guò)參與形成UniGeneCluster的序列的組織/細(xì)胞來(lái)源來(lái)間接地反映分析序列在何種組織中表達(dá)體現(xiàn)在字段cDNASources中。第23頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、核酸序列的電子基因定位分析對(duì)核酸序列進(jìn)行電子基因定位（即基因的染色體定位），通過(guò)所定位區(qū)帶的相鄰基因簇,間接地提示該基因的功能，是核酸序列分析的一個(gè)重要方面。進(jìn)行電子基因定位策略是：利用基因組序列定位A、將待分析序列進(jìn)行對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性檢索B、得到確定基因組序列后點(diǎn)擊“GenomeView”觀察其基因組結(jié)構(gòu)C、點(diǎn)擊用紅色標(biāo)記所指示的染色體列表中選擇所對(duì)應(yīng)的染色體及區(qū)域。第24頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、cDNA對(duì)應(yīng)的基因組序列分析EST和cDNA的基因組序列查詢對(duì)于了解該基因組結(jié)構(gòu)包括extron/intron結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域以及何種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控等均十分重要。同時(shí)，如果對(duì)所獲得cDNA不能完全確定的情況下，也可參考基因組的序列進(jìn)行校正。在人類基因組計(jì)劃推動(dòng)下，NCBI、EMBL、和SangerCentre均提供了基因組序列的同源性分析途徑。第25頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、通過(guò)從NCBI查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列的分析聯(lián)網(wǎng)至/genome/seq/HsBlast.html可直接對(duì)已經(jīng)公布的基因組序列進(jìn)行查詢。2、通過(guò)從Sanger中心查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列的分析http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/hgp第26頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、基于核酸序列對(duì)齊分析的功能預(yù)測(cè)對(duì)庫(kù)比較、多序列以及序列之間的兩兩比較、同源性比較及結(jié)果的顯著性評(píng)價(jià)、分子進(jìn)化樹的繪制。第27頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天七、可讀框架分析原理——Kozak序列：AUG上游的第三個(gè)核苷酸，常常是嘌呤，且多數(shù)是A；緊跟在AUG后面的核苷酸，常常也是嘌呤，但多數(shù)情況下是G。AUG附近的核苷酸序列中以ANNAUGN和GNNAUGPu(T/G)的利用率最高，而沒(méi)有起始功能AUG附近的核苷酸序列則無(wú)此保守性。/gorf/gorf.html第28頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第29頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第30頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第31頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第32頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天八、基因組序列中的編碼區(qū)/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析真核基因外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)就是指外顯子和內(nèi)含子的交界，又稱邊界序列。重要特征：

（1）內(nèi)含子的兩端序列之間沒(méi)有廣泛的同源性，不能互補(bǔ)。不能通過(guò)形成發(fā)卡式二級(jí)結(jié)構(gòu)。（2）外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)序列很短，但高度保守。第33頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天GT-AG法則：幾乎在所有高等真核生物基因中每個(gè)內(nèi)含子5′端起始的兩個(gè)堿基都是GT，3′端最后兩個(gè)堿基總是AG。目前最好并最流行的軟件是GRAIL（GeneRecognitionAnalysisInternetLink）套裝軟件/Grail-1.3/。第34頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第35頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第36頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第37頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天也可以利用GeneFinder軟件（/urllists/genefind.htm）進(jìn)行基因組序列的內(nèi)含子/外顯子分析。第38頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第39頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天九、基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析1、通過(guò)EBI匿名FTP獲得數(shù)據(jù)庫(kù)2、聯(lián)網(wǎng)至/seq_tools/promoter.html可對(duì)基因組序列進(jìn)行啟動(dòng)子分析。第40頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天十、重復(fù)序列分析1、RepBase

真核生物DNA中重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，由GeneticInformationResearchInstitute，GIRI維護(hù)，其網(wǎng)址為：/server/RepBase/。2、著名的RepeatMasker程序即基于此進(jìn)行工作（/RM/RepeatMasker.html)。第41頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)PCR引物設(shè)計(jì)第42頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、基本過(guò)程PCR是在試管內(nèi)有DNA模版、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在條件下，由DNA聚合酶催化的DNA合成反應(yīng)?；痉磻?yīng)過(guò)程分為三步：1、變性變性是指通過(guò)加熱使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，形成兩條單鏈的過(guò)程。加熱到92~95℃可使一切復(fù)雜的DNA都達(dá)到變性的目的。2、退火退火是指在溫度降低的過(guò)程中，DNA的復(fù)性過(guò)程，即變性后的兩條單鏈在堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上形成氫鍵，結(jié)合成雙鏈。第43頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、延伸

從引物的3′一端開始，沿DNA模版，由DNA聚合酶催化的DNA新鏈的合成反應(yīng)。上述三步反應(yīng)構(gòu)成一個(gè)循環(huán)。在下一個(gè)循環(huán)中，前一循環(huán)的產(chǎn)物再變性為兩條單鏈作為模版，這樣往復(fù)循環(huán)，即可使靶序列大大擴(kuò)增。第44頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、PCR的引物1、引物長(zhǎng)度以15~30個(gè)堿基為宜。過(guò)短會(huì)影響到擴(kuò)增的特異性。若擴(kuò)增產(chǎn)物≤500堿基，引物長(zhǎng)度為16~18堿基即可。若擴(kuò)增4~5kb的大片段，引物最好不要少于24個(gè)堿基。2、引物二聚體及二級(jí)結(jié)構(gòu)

盡量避免在引物分子之間或引物分子內(nèi)部有過(guò)多的互補(bǔ)堿基。如果很難完全避免引物分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，也要盡可能地避免在引物3′一端出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)。3′一端有二級(jí)結(jié)構(gòu)的引物不能有效引發(fā)延伸。第45頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、堿基分布的均衡性

避免嘌呤或嘧啶的堆積，避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的同一堿基。各種堿基最好分布均勻。4、引物在模版上結(jié)合位點(diǎn)的唯一性

保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。第46頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、堿基配對(duì)的嚴(yán)格性一般要求引物與模版間的堿基能完全配對(duì)特殊實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，部分堿基不配對(duì)是許可的。但要求引物3′一端必須與模版配對(duì)。如:①在5′一端引入酶切位點(diǎn)。②點(diǎn)突變。③設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。第47頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、引物的Tm值(解鏈溫度)

在允許范圍內(nèi)，選擇較高的溫度，可大大減少引物和模版之間非特異性結(jié)合，從而提高PCR的特異性。引物容易復(fù)性到模版上的溫度是Tm值減去15~25℃，但為了提高PCR的特異性，在實(shí)際應(yīng)用中常常將退火溫度設(shè)定為Tm值減去5~15℃。在實(shí)驗(yàn)之初，寧可選用較低的退火溫度，首先得到有PCR合成產(chǎn)物之后再逐步提高退火溫度，以提高反應(yīng)的特異性。兩條引物的Tm盡可能相等或接近，最好相差不超過(guò)3℃。第48頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天7、引物的內(nèi)部穩(wěn)定性

引物的5′端互補(bǔ)序列應(yīng)該是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3′端應(yīng)在堿基配對(duì)的情況下盡可能為低穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

3′端應(yīng)該選用A、T少選用G、C，這種引物有更高的引發(fā)效率，且能有效地避免假引發(fā)。第49頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、引物設(shè)計(jì)軟件的引物設(shè)計(jì)功能主要體現(xiàn)在：1、引物分析評(píng)價(jià)功能，以“Oligo6”最優(yōu)秀。2、引物的自動(dòng)搜索功能。以“PrimerPremier”為最強(qiáng)且方便使用在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。引物設(shè)計(jì)軟件以“Premier”進(jìn)行自動(dòng)搜索，“Oligo”進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，如此可快速設(shè)計(jì)出成功率很高的引物。第50頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天引物設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析DNA基元(motif)查找同源性分析第51頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物簡(jiǎn)并引物：根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA來(lái)設(shè)計(jì)引物，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。設(shè)計(jì)的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物。第52頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則：纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（InvertebrateMitochondrion）支原體（Mycoplasma）植物線粒體（PlantMitochondrion）原生動(dòng)物線粒體（ProtozoanMitochondrion）一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）脊椎動(dòng)物線粒體（VertebrateMitochondrion）酵母線粒體（YeastMitochondrion）第53頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第54頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第55頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第56頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第57頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第58頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天第59頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR模板及產(chǎn)物位置所選的上下游引物的一些性質(zhì)四種重要指標(biāo)的分析引物的最佳退火溫度對(duì)引物進(jìn)行修飾編輯第60頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天

此外還要注意：不同的引物3’端末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。第61頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端△G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5’端和中間的△G值相對(duì)較高的引物。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶。鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。選取引物時(shí)，宜選用3’端Frq值相對(duì)較低的片段。第62頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天選好上下游引物后檢查：1、引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。2、發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過(guò)4.5為好3、GC含量以45-55％為宜。4、如果模板不是基因組DNA，而是特定模板序列，最好還進(jìn)行Falseprimingsite的檢測(cè)。第63頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天按Alt+P鍵彈出PCR窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)。第64頁(yè),共80頁(yè)，2024