【HPV基因檢測技術(shù)探究進(jìn)展綜述5800字】

IIIHPV基因檢測技術(shù)研究進(jìn)展綜述摘要宮頸癌是全球第四大威脅女性身體健康的癌癥疾病。近幾年，宮頸癌高發(fā)和低齡化的變化導(dǎo)致了大家的關(guān)注。如今，宮頸癌預(yù)防的關(guān)鍵是宮頸癌的早診早治。篩查的意圖是辨別與診治宮頸癌的前驅(qū)病變，準(zhǔn)確高效地辨別此類異常宮頸病變。如今宮頸癌篩查手段類別繁多，人乳頭瘤病毒性別檢測技術(shù)是如今相對(duì)可靠安全的篩查選擇。如今，幾種先進(jìn)的人乳頭瘤病毒檢測技術(shù)不僅檢測率高，而且安全性好，可是彼此都有相應(yīng)的限制條件。本篇文章將詳細(xì)介紹人乳頭瘤病毒基因檢測技術(shù)的進(jìn)步，以更好的支持其臨床治療。關(guān)鍵詞：宮頸癌篩查；HPV基因檢測；細(xì)胞學(xué)檢測目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 12HPV及其致病機(jī)制 12.1HPV概述 12.2HPV流行病學(xué) 12.3HPV致病機(jī)制 23HPV基因檢測技術(shù)及其研究進(jìn)展 33.1細(xì)胞學(xué)檢測方法 33.2基于DNA檢測方法 43.3基于RNA檢測方法 54HPV預(yù)防與宮頸癌治療 55前景展望 6參考文獻(xiàn) 71前言宮頸癌是全球第四大威脅女性身體健康的癌癥疾病，宮頸癌的發(fā)病率只低于乳腺癌，嚴(yán)重危害著世界上女性的生命與健康。近幾年，宮頸癌漸漸趨向年輕化不斷引發(fā)人們的注意。而如今在中國，宮頸癌的病發(fā)率每年都呈上漲趨勢。宮頸癌的出現(xiàn)來自宮頸上皮內(nèi)瘤變，為早日看出無明顯癥狀女性的高級(jí)別病灶，必須進(jìn)行關(guān)于宮頸癌的篩檢，以預(yù)防其成長成浸潤性疾病[1]。而HPV基因檢測技術(shù)的研究工作是展開宮頸癌篩查的實(shí)踐方法，必須醫(yī)學(xué)研究者多加注意，那么本篇文章就會(huì)對(duì)HPV基因檢測技術(shù)及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜合敘述，希望能為醫(yī)務(wù)工作者的研究提供便利。2HPV及其致病機(jī)制2.1HPV概述HPV屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，它是一種球形、沒有包膜的小環(huán)狀雙鏈DNA病毒。到如今為止，醫(yī)學(xué)研究者已剝離和鑒別了200多種類型的人乳頭瘤病毒，能夠把其按照病原性的差異分成高風(fēng)險(xiǎn)與低風(fēng)險(xiǎn)類型[2]。高風(fēng)險(xiǎn)HPV和一部分頭頸腫瘤、外陰癌、陰莖癌、陰道癌等有關(guān)，還與宮頸癌的出現(xiàn)有緊密聯(lián)系。主要的傳播方式是性傳播，在發(fā)生性行為后，男性生殖器感染HPV的概率比女性要高，但因HPV持續(xù)存在的幾率較小而罹患癌癥風(fēng)險(xiǎn)極低，但是由于女性宮頸和陰道的生理結(jié)構(gòu)，病毒更易滋生，因此相較于男性更易感染HPV，女性在HPV感染后的臨床癥狀表現(xiàn)為宮頸部位發(fā)生病變，例如白帶變多、不規(guī)律出血、宮頸糜爛和腹痛等。按照全世界婦科癌癥發(fā)病率計(jì)算，宮頸癌位列第四名，另外值得關(guān)注的是，其中大于60%的病人源自南非和拉丁美洲等落后國家[3]。2.2HPV流行病學(xué)人乳頭瘤病毒是一種相對(duì)多見的DNA病毒，在人群里普遍傳播。因?yàn)槠渥韵扌裕芏嗳巳轭^瘤病毒感染不能產(chǎn)生癥狀。所以，其流行病學(xué)很難完全了解。迄今為止，流行病學(xué)探索表明，大家普遍容易感染多種類型的人乳頭瘤病毒病毒，性活躍的年輕群體最有可能感染人乳頭瘤病毒病毒。如今，關(guān)鍵傳染源源于人乳頭瘤病毒患者及其攜帶者，重點(diǎn)傳播渠道是性接觸。近些年，人乳頭瘤病毒感染人數(shù)大幅提升，并表現(xiàn)出顯著增長的趨勢，特別是在輕年群體中[4]。中國20世紀(jì)70年代到今天的全國死因研究表明，與1990年至1992年與1973年至1975年相比，2004年至2005年中國女性癌癥患者死于宮頸癌的比例有暫時(shí)降低。可2012年《中國惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率分析報(bào)告》顯示，因?yàn)閷m頸癌形成的死亡率每年都會(huì)增長8.1%。另一方面，2018年在全世界新增宮頸癌大概有56.9萬例，涵蓋了約31.1萬的死亡病例，84%的死亡病例出現(xiàn)在經(jīng)濟(jì)滯后國家。預(yù)估在2030年這一比重將上升到98%[5]。遵循中國癌癥中心頒布的資訊，近些年宮頸癌每年的發(fā)病增長率到達(dá)了8.7%。此外，按照最新的研究報(bào)告，盡管在我國東部地區(qū)，特別是中西部地區(qū)，宮頸癌死亡率持續(xù)提升，死亡率依舊很高，可相比過去已經(jīng)有了顯著的減少。2.3HPV致病機(jī)制HPV基因根據(jù)各種DNA序列調(diào)控作用的區(qū)別，可以將HPV基因分成上游調(diào)控區(qū)、早、晚期區(qū)。上游調(diào)控區(qū)涵蓋一個(gè)順式調(diào)控單元以及人乳頭瘤病毒病毒的復(fù)制起始，擔(dān)負(fù)調(diào)控病毒基因的拷貝以及轉(zhuǎn)錄開始；早期調(diào)控區(qū)可以編碼早期蛋白質(zhì)E1-E2、E4-E7，經(jīng)過影響DNA拷貝，RNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)翻譯的經(jīng)過，涉及人乳頭瘤病毒病毒的全體生命周期；晚期調(diào)控區(qū)擔(dān)負(fù)編碼晚期蛋白L1與L2，就是病毒的外殼蛋白，病毒的外殼蛋白是病毒包裝、細(xì)胞表面吸附、細(xì)胞質(zhì)入侵的主要蛋白[6]。對(duì)人乳頭瘤病毒來說，蛋白E1-E2、E4-E7是增殖和繁殖的非常重要的作用蛋白。經(jīng)過認(rèn)清這些蛋白質(zhì)的詳細(xì)作用，去清楚人乳頭瘤病毒基因的致病原因。E2蛋白在人乳頭瘤病毒基因轉(zhuǎn)錄的各個(gè)階段實(shí)施對(duì)應(yīng)的調(diào)控功能。當(dāng)病毒寄生并開始與被寄生者基因組結(jié)合的時(shí)候，E2蛋白可以特異性識(shí)別且融合E2BS，進(jìn)而引起特異性蛋白SP1與TATA結(jié)合蛋白TBP的易位，以此壓制病毒轉(zhuǎn)移的經(jīng)過。相應(yīng)的研究報(bào)道顯示，當(dāng)將E2基因?qū)雽m頸癌細(xì)胞SiHa中后，癌細(xì)胞數(shù)量因此明顯下降，說明癌細(xì)胞的發(fā)展受到抑制；另一方面有探索發(fā)現(xiàn)，在和被寄生者基因組組合的癌細(xì)胞里，E2基因在甲基化狀態(tài)，表明當(dāng)E2基因甲基化而無法起到功能的時(shí)候，癌細(xì)胞才可以穩(wěn)定裂變，表示了E2蛋白對(duì)人乳頭瘤病毒轉(zhuǎn)移的阻礙功能[7]。E5蛋白在持續(xù)人乳頭瘤病毒感染經(jīng)過中發(fā)揮持續(xù)和介導(dǎo)免疫缺陷的功能。在病毒與宿主細(xì)胞基因組整合后，細(xì)胞內(nèi)受體酪氨酸激酶（Met）的表達(dá)被E5蛋白上調(diào)，從而維持病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程延續(xù)其生命周期。當(dāng)外源DNA入侵女性自身免疫系統(tǒng)時(shí)，宮頸上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，在基底層發(fā)生分裂并迅速凋亡、脫落，從而盡量減小病毒對(duì)人體帶來的危害。E5蛋白的關(guān)鍵功能是增加環(huán)氧化酶-2的表達(dá)，在促凋亡有關(guān)的Bax基因的降解中發(fā)揮用處，并激活表皮生長因子受體EGFR，減緩基底細(xì)胞的分離與分裂，保證病毒可以繼續(xù)穿透有色的宮頸上皮細(xì)胞。在介導(dǎo)免疫反應(yīng)方面，高危險(xiǎn)人乳頭瘤病毒感染早期的宿主自身免疫能夠形成很多CD8+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞是擁有特殊辨識(shí)腫瘤細(xì)胞功能的T細(xì)胞。辨識(shí)腫瘤細(xì)胞外觀最重要的組織相容性復(fù)合MHC分子引起腫瘤細(xì)胞死亡，而E5蛋白擁有疏水區(qū)，可以和MHC分子的重鏈有交互功能，使E5蛋白的疏水區(qū)變成MHC的抗原代表，導(dǎo)致被寄生者免疫反應(yīng)減弱。E5蛋白介導(dǎo)被寄生者免疫反應(yīng)并降低宿主抗病毒能力。E6和E7蛋白是重要的致癌因素。E6和E7蛋白在感染細(xì)胞的部位會(huì)影響其致病水平。在它出現(xiàn)在受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，不能引發(fā)其惡性轉(zhuǎn)變，可在出現(xiàn)在被寄生者細(xì)胞核中時(shí)，它們能誘導(dǎo)人乳頭瘤病毒陽性癌細(xì)胞的惡性表型。由探索發(fā)現(xiàn)，在E6蛋白的羧基端有一個(gè)PDZ結(jié)合基序。E6蛋白能運(yùn)用PBM和PDZ蛋白的交互，推動(dòng)病毒進(jìn)入細(xì)胞中，進(jìn)而誘發(fā)感染，可以深入的把人乳頭瘤病毒、E6蛋白融合到降解p53基因，還可以用腫瘤抑制基因pRb當(dāng)做結(jié)合靶點(diǎn)，阻礙腫瘤細(xì)胞死亡。3HPV基因檢測技術(shù)及其研究進(jìn)展人乳頭瘤病毒基因的實(shí)驗(yàn)室檢測辦法有非常多，重點(diǎn)分為三種:細(xì)胞學(xué)檢測辦法、DNA檢測辦法和RNA檢測辦法。3.1細(xì)胞學(xué)檢測方法細(xì)胞學(xué)檢測辦法是拭子和液基細(xì)胞學(xué)等檢驗(yàn)手段。它還能夠經(jīng)過檢測脫落子宮細(xì)胞中的單克隆人乳頭瘤病毒L1蛋白抗體來確定病人是不是感染了人乳頭瘤病毒病毒。它適合在臨床方面進(jìn)行普查，這種檢驗(yàn)手段的特征是：特異性高，實(shí)行方便簡單，可靈敏程度比較差，總體檢驗(yàn)效率不高，成本低，無法完成人乳頭瘤病毒分型[8]。但是，目前隨著人工智能的不斷發(fā)展，AI輔助細(xì)胞學(xué)檢測已經(jīng)獲得了較大進(jìn)展，通過研究發(fā)現(xiàn)，在一樣的情況下，人工智能輔助測量的靈敏度(相對(duì)敏感性1.01，95%CI：0.97-1.05)宛如細(xì)胞學(xué)學(xué)家，并且AI輔助閱讀的特異性甚至高于細(xì)胞學(xué)專家(相對(duì)特異性1.26，95%CI：1.20-1.32)。在將來，人工智能支持的檢測可以在極大層面上杜絕細(xì)胞學(xué)檢測的缺點(diǎn)。3.2基于DNA檢測方法人乳頭瘤病毒DNA檢測的基礎(chǔ)原理是基于相補(bǔ)互配的原理，運(yùn)用探針與病毒基因序列的特異性結(jié)合，對(duì)于人乳頭瘤病毒基因組上存在的特異性序列的引物或探針設(shè)計(jì)。選擇PCR增殖的方式取得預(yù)計(jì)的段落，然后開展定性或定量檢測。和以往的檢驗(yàn)手段對(duì)比，DNA檢驗(yàn)擁有很高的靈活性和特殊性，并可以達(dá)成人乳頭瘤病毒分型，可也有個(gè)問題，就算是在寄生宮頸細(xì)胞中檢測到人乳頭瘤病毒DNA片段，也僅僅是表示有病毒存在，不表示有宮頸病變。截止今日，人乳頭瘤病毒DNA檢驗(yàn)的手段有很多，各種手段都是有利有弊的[9]。（1）芯片雜交技術(shù)是先用酶標(biāo)記人乳頭瘤病毒靶的基因序列，然后將酶標(biāo)記與固相載體上的樣品分子雜交顯色，從而在樣品上完成各種人乳頭瘤病毒亞型的解析。但不足是實(shí)施繁雜，容易交叉感染；好處是通量高、速度快的特點(diǎn)。另一方面，AdvanSure與雙重巢式PCR是基于PCR展開優(yōu)化的，基本操作是差不多的，不一樣的是引物規(guī)劃的時(shí)候展開多個(gè)引物規(guī)劃，可以達(dá)成多種人乳頭瘤病毒亞型的檢驗(yàn)，這種手段的好處是精確度高，不足的是可能出現(xiàn)感染[10]。（2）數(shù)字PCR技術(shù)，就是“第三代PCR”，是一種利用數(shù)字PCR儀，在缺乏標(biāo)準(zhǔn)曲線的狀況下，對(duì)分子靶標(biāo)展開絕對(duì)定量檢測的科技。它用于特殊的急診病人。其特征是定量精準(zhǔn)，檢驗(yàn)的高敏度，可不足的是成本較高，實(shí)行比較麻煩等。（3）當(dāng)下瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科選擇了PCR毛細(xì)電泳片段分析法進(jìn)行人乳頭瘤病毒檢測和基因分型試劑盒，原理是利用多重PCR和毛細(xì)電泳技術(shù)，針對(duì)宮頸細(xì)胞的E6、E7、E1基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，將不同HPV型別分類的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及毛細(xì)電泳分離，由于不同基因擴(kuò)增片段的長度不同，毛細(xì)電泳后條帶的位置也因此不同，這樣就能夠在一次檢測中對(duì)多種HPV型別進(jìn)行同步分型。瑞金人乳頭瘤病毒核酸檢測和基因分型試劑盒主要用在女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本中25種人乳頭瘤病毒基因型的體外定性檢測。這25種HPV基因型別包括：6、11、16、18、26、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83等，它可用于臨床輔助診療，可無法用在宮頸癌篩查的預(yù)期用途。好處是操作簡單標(biāo)準(zhǔn)，可同時(shí)鑒定多個(gè)人乳頭瘤病毒基因型，定性檢測結(jié)果重現(xiàn)性好，可普遍應(yīng)用于臨床。不足是采樣、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、加工都有一定的需要。若是未達(dá)到前提條件，就會(huì)妨礙測試成果。試劑盒的檢測結(jié)果只提供臨床借鑒。還應(yīng)廣泛考慮病人的臨床癥狀或體征和實(shí)驗(yàn)室檢查的各種狀況，并給予最后判斷。整體而言，根據(jù)DNA的檢驗(yàn)手段難以同時(shí)具有靈敏度、特異性以及效率成本，在真實(shí)臨床使用中，必須按照不一樣的情況給予對(duì)應(yīng)的抉擇，以實(shí)現(xiàn)更高效、精準(zhǔn)的檢測。3.3基于RNA檢測方法人乳頭瘤病毒DNA檢測的基本原理類似于人乳頭瘤病毒DNA檢測，可經(jīng)過人乳頭瘤病毒的致病原因，我們可以看出病毒DNA是經(jīng)過結(jié)合到被寄生者基因組中，經(jīng)過轉(zhuǎn)移和翻譯后起到用處的，因此可以看出，與人乳頭瘤病毒mRNA檢測比較，人乳頭瘤病毒DNA檢測在臨床上最先更精準(zhǔn)地檢測出人乳頭瘤病毒感染者。醫(yī)護(hù)研究者對(duì)細(xì)胞學(xué)正常且人乳頭瘤病毒mRNA檢驗(yàn)出陽性的婦女展開組織學(xué)篩檢，成果看出了17.3%(95%CI：16.2-18.4)CIN3+和16.4%(95%CI：15.3-17.5)CIN2+的患者，此外，人乳頭瘤病毒mRNA檢測與細(xì)胞學(xué)分別進(jìn)行，結(jié)果顯示人乳頭瘤病毒mRNA檢測的敏感性更高，而細(xì)胞學(xué)的特異性更高。另外，GRANADOS等人篩選了35歲之內(nèi)的人乳頭瘤病毒mRNA檢測陽性的女性群體，發(fā)現(xiàn)CIN2+病變的發(fā)生率最高，當(dāng)HPV16/18/45陽性的時(shí)候，總體活檢表明CIN2+病變的所有病人都是人乳頭瘤病毒mRNA陽性。對(duì)低度鱗狀上皮內(nèi)和不典型鱗狀上皮細(xì)胞病變來說，通過HPVmRNA檢測的結(jié)果比HPVDNA檢測的特異性更高，結(jié)果相對(duì)更加可靠。人乳頭瘤病毒DNA檢測往往更容易實(shí)現(xiàn)高敏度，可由總體而言，特異性較差。按照探索成果看出，人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測在統(tǒng)計(jì)分析中比人乳頭瘤病毒DNA檢測具有更好的陽性預(yù)測值和更厲害的特異性，而且無論是人乳頭瘤病毒mRNA檢測或是人乳頭瘤病毒DNA檢測，陽性百分比均跟隨病變而改變。此外，經(jīng)過人乳頭瘤病毒mRNA檢測的活檢成果表示其≥HSIL的特殊性與陽性預(yù)測價(jià)值顯然大于DNA檢驗(yàn)。所以，大家能夠發(fā)現(xiàn)，人乳頭瘤病毒mRNA檢測與人乳頭瘤病毒DNA檢測比較具有特殊的好處，具有更好的臨床應(yīng)用價(jià)值，HPVmRNA檢測可用作臨床風(fēng)險(xiǎn)分層。4HPV預(yù)防與宮頸癌治療宮頸癌的早期診斷與人乳頭瘤病毒疫苗的開發(fā)和使用是預(yù)防人乳頭瘤病毒的關(guān)鍵舉措，可以大大減小宮頸癌的死亡率。在欠發(fā)達(dá)國家，接種疫苗或許是根除宮頸癌的一種有效的長時(shí)間舉措。人乳頭瘤病毒的疫苗有預(yù)防性疫苗與治療性疫苗。迄今為止，疫苗探索重點(diǎn)集中在高風(fēng)險(xiǎn)的人乳頭瘤病毒病毒類型上。預(yù)防性疫苗誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，形成相應(yīng)量的抗體，以長期預(yù)防人乳頭瘤病毒感染。如今，中國正在全面普及適當(dāng)年齡組接種預(yù)防疫苗。臨床試驗(yàn)成果表明，如今市場上的九價(jià)疫苗可以預(yù)防不同種類的人乳頭瘤病毒導(dǎo)致的高質(zhì)量的宮頸、外陰和陰道病變，并且疫苗的預(yù)防成效時(shí)間持續(xù)長，能夠達(dá)到六年以上。治療性疫苗的作用理論是經(jīng)過喚醒被寄生者細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)來形成T細(xì)胞或溶菌酶，來消滅病變的細(xì)胞，治療性疫苗指向的靶抗原常常是E6和E7重點(diǎn)致病蛋白，它們可以由再一次激活被寄生者特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答來消滅病變的細(xì)胞。盡管疫苗具有明顯的預(yù)防與治療成果，可價(jià)格很貴，需要保持低溫輸送。如今，很多欠發(fā)達(dá)國家沒有推廣它們的前提。如今，研發(fā)更有效、更有指向性的疫苗是研究者的重點(diǎn)方向，這必須進(jìn)一步了解人乳頭瘤病毒基因組及其致病蛋白，為宮頸癌的臨床治療供應(yīng)新想法。比如：發(fā)現(xiàn)miR-221在SOCS1/TypeIIFN信號(hào)通路中發(fā)揮重要功能，并可能壓制人乳頭瘤病毒DNA的復(fù)性；lncRNASNGH12、TMPOP2和lnc-CCDST的表達(dá)程度可能對(duì)人乳頭瘤病毒E6和E7蛋白的活性有顯著影響。以上探索結(jié)果都會(huì)變成隱性的醫(yī)療靶向，并提供更多論據(jù)給研究新型藥物。最終，為了防范人乳頭瘤病毒，你必須形成較好的日常習(xí)慣。長時(shí)間吸煙、雙胞胎、衣原體以及長時(shí)間使用激素避孕藥會(huì)提升宮頸癌的危險(xiǎn)。所以宮頸癌預(yù)防一般從三個(gè)方面開始：第一，是增強(qiáng)生活習(xí)慣知識(shí)；第二，是宮頸癌早期診斷存活；第三，是疫苗以及藥物干預(yù)。5前景展望高危人乳頭瘤病毒的高致病性嚴(yán)重?fù)p害了世界女性的健康理念，產(chǎn)生了不良后果。大家已形成較好的日常習(xí)慣和早預(yù)防、早接種、早發(fā)現(xiàn)、早整治的可預(yù)防宮頸癌的有效手段。經(jīng)過評(píng)估近年來研究者在人乳頭瘤病毒的檢測、預(yù)防與治療上的科研進(jìn)度，大家能夠看到，雖然研究者在人乳頭瘤病毒致病機(jī)制的探索方面取得了許多成就，但在人乳頭瘤病毒的檢測和預(yù)防方面也有很多有效的方法。然而，實(shí)際上，因?yàn)楹芏嘁蛩?，這種疾病依舊給世界各地的很多婦女增添問題。我們需要做的是立足眼前，盡量多的處理問題，讓這種疾病盡快從大家的視野中消失。參考文獻(xiàn)黃曉梅.宮頸癌的早期癥狀及影響因素研究[J].中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育,2018,10(7):79-80.陳萬青,鄭榮壽,張思維,等.2012年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2016,25(1):1-8.包鶴齡,劉韞寧,王黎君,等.中國2006-2012年子宮頸癌死亡情況與變化趨勢分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2017,38(1):58-64.陳一凡,戚欣,李靜,等.宮頸癌的發(fā)病機(jī)制?藥物治療及新治療策