一種提高黃素氧化酶活力的方法

一種提高黃素氧化酶活力的方法專(zhuān)利名稱：一種提高黃素氧化酶活力的方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種利用血紅蛋白VHb提高黃素氧化酶活力的方法。背景技術(shù)：在氧氣缺乏的環(huán)境下，一種好氧細(xì)菌透明顫菌(P7/MMc!/"sp.)能夠合成血紅蛋白(版,函Hemoglobin,VHb)(Wakabayashi，S.，etal.Nature.1986,322,481-483;Dikshit，K.L.,etal.NucleicAcidsRes.1990，18,4149-4155)。VHb為同型二聚體,帶有兩個(gè)相對(duì)分子量為15,775的亞基，每個(gè)亞基含有146個(gè)氨基酸殘基和兩個(gè)b型血紅素(Tarricone,C.,etal.Structure.1997,5,497-507)。完整的VHb是可溶性的，但是脫去血紅素輔基便不可溶。VHb已在細(xì)菌，酵母，真菌和植物細(xì)胞中獲得了成功表達(dá)，在低氧環(huán)境下能提高宿主細(xì)胞生長(zhǎng)量(Kallio,RT.andBailey，J.E..Biotechnol.Prog.1996,12,31-39)，提高相應(yīng)酶的表達(dá)量(Bhave,S.L.andChattoo,B.B..Biotechnol.Bioeng.2003,84，658-666)和有價(jià)值的中間代謝物的產(chǎn)量，在體內(nèi)表達(dá)VHb有顯著效果的例子有大腸桿菌中OC—淀粉酶活力提高了3.3倍(Khosravi，M.，etal..Plasmid.1990,24，190-194)，鐵蛋白表達(dá)量提高了1.8倍(Chung,Y.J.,Kim，etal..Mol.Biol.1998,31,503-507);產(chǎn)黃頂頭孢霉菌C4crewo"iww中頭孢菌素C(CPC)產(chǎn)量提高3.2倍(Demodena,J.A.,etal.Bio-Technology.1993,11,926-929);促進(jìn)了假單胞菌(/^Womo"wsp.)對(duì)有機(jī)污染物苯甲酸降解和伯克霍爾德菌(5wr編c/mVsp.)對(duì)2,4—二硝基甲苯降解(Kim，Y"etal..J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2005,32,148-154)。研究表明，當(dāng)VHb在異源宿主中表達(dá)可以提高tRNAs和核糖體水平、細(xì)胞呼吸活力和ATP產(chǎn)量(Nilsson,M,etal.Biotechnol.Prog.1999，15,158-163;Roos，V"etaLBiotechnol.Prog.2002，18,652-656)，但是，人們還是沒(méi)有完全搞清楚新陳代謝效果和血紅蛋白VHb功能之間的聯(lián)系。VHb具有一個(gè)高的氧結(jié)合和釋放系數(shù)(Giangiacomo，L.，etal..Biochemistry.2001,40,9311-9316),高氧結(jié)合系數(shù)反映了VHb有較高的氧結(jié)合能力，但是更高的氧釋放系數(shù)表明VHb能夠更迅速釋放氧(Webster,D.A..Structureandfunctionofbacterialhemoglobinandrelatedproteins.InEichorn，G.C.andMarzilli，L.G.(eds.)，Advancesininorganicbiochemistry,NewYork,Elsevier,1987,.pp.245-265)。VHb與紅酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)融合后在大腸桿菌中獲得成功表達(dá)，得到的融合蛋白VHb-DAO轉(zhuǎn)化CPC的催化效率提高了i2.5倍，穩(wěn)定性提高約3倍(Khang，Y.H.,etal.Biotechnol.Bioeng.2003，82,480-488)。Khang等提出，由于VHb中潛在位點(diǎn)與DAO中FAD結(jié)合域存在較強(qiáng)的相互作用，使得VHb同時(shí)起到了一個(gè)氧供體和氧受體作用。由于DAO是一種黃素氧化酶，其以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔因子，而VHb與紅酵母DAO融合后能夠提高CPC的氧化效率，因此我們推測(cè)VHb在反應(yīng)體系中起到氧載體作用，因?yàn)镈AO催化過(guò)程中需要氧氣，所以VHb的存在增強(qiáng)了DAO的催化效率。發(fā)明內(nèi)容為了驗(yàn)證上述推測(cè)，本申請(qǐng)的發(fā)明人分別以游離的和固定化的透明顫菌血紅蛋白(VHb)對(duì)三種黃素氧化酶——三角酵母D—氨基酸氧化酶(DAO)、葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)的催化活性的影響進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，不管是游離的還是固定化的VHb,對(duì)于黃素氧化酶的催化活性都有明顯的增效作用。因此，本發(fā)明的首要目的就在于提供一種提高黃素氧化酶催化活性的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種VHb用于促進(jìn)黃素氧化酶催化活性的應(yīng)用。本發(fā)明的提高黃素氧化酶催化活性的方法包括將VHb作為助催化劑用于黃素氧化酶的催化反應(yīng)體系，所述VHb可以是游離的形式，也可以是固定化酶的形式。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的使用VHb作為助催化劑的方法，可以顯著提高黃素氧化酶的催化氧化的能力；而且，相比現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的融合蛋白的形式，本發(fā)明的方法可以在催化氧化過(guò)程中，通過(guò)外源添加的方式補(bǔ)充VHb，因此，在實(shí)際應(yīng)用中更有優(yōu)勢(shì)。圖1為用于在重組大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)重組血紅蛋白VHb的重組表達(dá)質(zhì)粒pHVHB的構(gòu)建流程圖。圖2為樣品不同純化階段的SDS(15%)電泳圖，凝膠用考馬斯亮蘭染色，其中1和6為Marker,2為重組菌株BL21(DE3)/pLHB-3的粗提物，3為使用含有500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫的HDAO，其分子量為41.4kDa，4為重組菌株BL21(DE3)/pHVHB的粗提物，5為使用含有500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫的HVHb,其分子量為17.9kDa。圖3顯示了固定化VHb對(duì)固定化HDAO酶活性的影響。圖4顯示了游離VHb對(duì)固定化HDAO酶活性的影響。圖5顯示了游離VHb對(duì)固定化GOD和固定化AOD酶活性的影響。圖6顯示了固定化VHb對(duì)固定化GOD和固定化AOD酶活性的影響。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明，HDAO為帶有組氨酸純化標(biāo)簽的D—氨基酸氧化酶(DAO)，HVHB為帶有組氨酸標(biāo)簽的透明顫菌血紅蛋白(VHb)。本發(fā)明中，VHb的基因表示為vg6或者Z/v/^或者v/^;DAO的基因表示為kfao;融合蛋白HVDAO的基因表示為Zvctoo。以下實(shí)施例中，除特別說(shuō)明外，DNA片段連接、質(zhì)粒的制備、化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主菌、克隆等操作均參照《分子克隆》(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.R,Maniatis，T.(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual3rded，，'ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。以下對(duì)實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料及其來(lái)源作說(shuō)明親和純化樹(shù)脂SepabeadsFP-IDA-N產(chǎn)購(gòu)自ResindionR.S丄公司；固定化載體為環(huán)氧型載體，其中SepabeadsEXE16，SepabeadsEc-Ep購(gòu)于ResindionR.S丄公司)；EupergitC禾卩EupergitCM購(gòu)于Degussa公司；Amberzymeoxiraneresin購(gòu)于Rohm&Haas公司。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購(gòu)于Takara公司。醇氧化酶(AOD)購(gòu)于Sigma公司；葡萄糖氧化酶(GOD)購(gòu)自TOYOBO公司，其他化學(xué)試劑都為分析純。質(zhì)粒pET-28b(+):Novagen公司產(chǎn)品，大小為5.3kb，含有組氨酸純化標(biāo)簽以及卡那霉素抗性基因，啟動(dòng)子是T7/flc，并具有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基中酵母膏，蛋白胨購(gòu)于OXOID公司。大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)購(gòu)于Novagen公司。實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pHVHB的構(gòu)建構(gòu)建重組質(zhì)粒pHVHB的過(guò)程如圖l所示，具體如下首先設(shè)計(jì)如下擴(kuò)增引物VHBF2(上游)5'-GGAATTCCATATGTTAGACCAGCAAACC-3';和VHBR2(下游)5，-CCCAAGCTTTTATTCAACCGCTTGAGCGTA-3，以pUC-6S-VHb(CGMCC1.6352)為模板，采用p/w酶(Sangon公司)擴(kuò)增Genbank序列號(hào)為X13516的vA6基因片段。PCR反應(yīng)條件為:94°C，30Sec，55。C，30Sec，72°C，30Sec，30個(gè)循環(huán)。使用上海華舜生物工程公司試劑盒，割膠回收PCR產(chǎn)物。PCR回收產(chǎn)物用M/eI和///"dlll雙酶切，割膠回收約450bp的DNA片段，與經(jīng)相同酶切的載體pET-28b(Novagen公司產(chǎn)品，大小為5.3kb，含有組氨酸純化標(biāo)簽以及卡那霉素抗性基因，啟動(dòng)子是T7/"c，并具有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn))載體在T4DNA連接酶作用下連接，連接條件為16'C連接4h;外源DNA與載體的摩爾比例是3:1。連接產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a以擴(kuò)增重組質(zhì)粒，然后參考《分子克隆》以堿裂解法抽提質(zhì)粒。得到的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pHVHB,該質(zhì)粒大小約為5.8kb，含有組氨酸純化標(biāo)簽以及卡那霉素抗性基因，啟動(dòng)子是T7toc，并具有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。重組表達(dá)質(zhì)粒pHVHB經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為正確。實(shí)施例2、重組質(zhì)粒pHVHB轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)將重組表達(dá)質(zhì)粒pHVHB用化學(xué)轉(zhuǎn)化法(CaCb法)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有50pg/m卡那霉素的LB平板上，能在含卡那霉素的平板上生長(zhǎng)的即為轉(zhuǎn)化子，獲得的轉(zhuǎn)化子命名為BL21(DE3)/pHVHB。實(shí)施例3、VHb的制備3.1、BL21(DE3)/pHVHB的發(fā)酵取實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)化有重組表達(dá)質(zhì)粒pHVHB的轉(zhuǎn)化子BL21(DE3)/pHVHB，接種到含有50tig/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后按照5%接種量將種子液接入裝有3LTB培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在37。C，400rpm，1.3vvm的條件下培養(yǎng)至OD,達(dá)到1.0。調(diào)節(jié)溫度至3(TC，加入乳糖使其終濃度為1.5%，繼續(xù)培養(yǎng)約20h。發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液在5000rpm下離心10min，菌體在一20'C下保存。3.2、VHb的分離純化所有蛋白質(zhì)純化操作主要在4°C進(jìn)行。3.2.1、菌體處理取凍融的菌體，按照每克菌體加入2ml裂解緩沖液(O.IM磷酸鈉，5%甘油，pH8.0)的比例，用裂解緩沖液重懸菌體，并用壓榨機(jī)在2000P.S.I的操作壓力下破碎細(xì)胞，工作3個(gè)循環(huán)。破碎后的菌液在4。C，12000rpm離心lh，回收上清液。3.2.2、蛋白質(zhì)柱分離稱取經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂F(xiàn)P-IDA-Np+裝柱，柱的尺寸是2cmx50cm，裝柱的樹(shù)脂約為20ml。將上述步驟3.2.1獲得的上清液上柱，上柱速度為1.0柱體積/小時(shí)(1BV/h)。使用WashingBuffer(100mM7Hs-Cl，50mM咪啤，250mMNaC1,5%甘油，速度1.0BV/h)洗去雜蛋白。過(guò)程中測(cè)定過(guò)氧化氫酶(上清液中所含雜蛋白)，當(dāng)過(guò)氧化氫酶活力為零時(shí)，結(jié)束Washing階段。然后使用ElutionBuffer(100mMJHy-Cl，500mM咪唑，250mMNaC，5%甘油，速度1.0BV/h)洗脫目的蛋白。3.2.3、電泳分析分別取步驟3.2.1離心獲得的上清液(粗酶液)和步驟3.2.2柱分離獲得的純化的蛋白樣品，使用15%SDS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。由圖2的結(jié)果可見(jiàn)，利用樹(shù)脂F(xiàn)P-IDA-N產(chǎn)一步法純化，可以得到純化的重組血紅蛋白HVHb。HVHb成熟蛋白的氮基酸殘基數(shù)是166aa，理論分子量推算出來(lái)應(yīng)該是17.9kDa;從SDS結(jié)果可見(jiàn)，目的蛋白的分子量大致在14和21kDa的中間位置，與理論推算值相符。實(shí)施例4、D—氨基酸氧化酶(DAO)的制備4.1、DAO表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)本實(shí)施例中所使用的質(zhì)粒pLHB-3按照劉洪波等(劉洪波等，生物工程學(xué)報(bào)，1999，15(3):337-342)的方法構(gòu)建，大小為6.4kb，含有帶組氨酸純化標(biāo)簽的DAO基因(HDAO基因)以及卡那霉素抗性基因，啟動(dòng)子是T7/ac。以DAO的表達(dá)質(zhì)粒pLHB-3轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)(Novagen公司)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有50pg/ml卡那霉素的LB平板上，能在含卡那霉素的平板上生長(zhǎng)的即為轉(zhuǎn)化子，獲得的轉(zhuǎn)化子命名為BL21(DE3)/pLHB-3。4.2、重組菌株發(fā)酵獲得DAO取4.1得到的重組菌株BL21(DE3)/pLHB-3，接種到含有50嗎/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37"培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后按照5%接種量將種子液接入裝有3LTB培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在37。C，400ipm，1.3vvm的條件下培養(yǎng)至OD,達(dá)到1.0。調(diào)節(jié)溫度至30。C,加入乳糖使其終濃度為1.5%，繼續(xù)培養(yǎng)約20h。發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液在5000rpm下離心10min，菌體在-20。C下保存。4.3、DAO的分離純化4.3.1、菌體處理取凍融的菌體，按照每克菌體加入2ml裂解緩沖液(O.IM磷酸鈉，5%甘油，pH8.0)的比例，用裂解緩沖液重懸菌體，并用壓榨機(jī)在2000RS.1的操作壓力下破碎細(xì)胞，工作3個(gè)循環(huán)。破碎后的菌液在4'C，12000rpm離心lh，回收上清液。4.3.2、蛋白質(zhì)柱分離稱取預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂F(xiàn)P-IDA-N產(chǎn)裝柱，柱的尺寸是2cmx50cm，裝柱的載體約為20ml。樣品上柱速度是1.0柱體積/小時(shí)(lBV/h)。使用WashingBuffer(100mM7Hy-Cl,50mM咪唑，250mMNaCl，5%甘油，速度1.0BV/h)去除雜蛋白。過(guò)程中測(cè)定過(guò)氧化氫酶，當(dāng)過(guò)氧化氫酶活力為零時(shí)，結(jié)束Washing階段。然后使用ElutionBuffer(100mM7h>Cl,500mM咪唑，250mMNaCl，5%甘油，速度1.0BV/h)，洗脫目的蛋白。4.3.3、電泳分析分別取步驟4.3.1獲得的上清液(粗酶液)和步驟4.3.2柱分離獲得的純化的蛋白樣品，使用15%SDS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。HDAO成熟蛋白的氨基酸殘基數(shù)是376aa，理論分子量推算出來(lái)應(yīng)該是41.4KDa。由圖2的結(jié)果可見(jiàn)，目的蛋白的分子量略小于43Kda，與理論推算值相符。實(shí)施例5、固定化酶的制備5.1、固定化VHb的制備選用Amberzymeoxiraneresin載體，VHb溶液的濃度為6.8mg/ml，按照每120mg蛋白使用lg載體的比例將載體投入VHb純酶液中，再加入兩倍體積的1.25M、pH8.0的磷酸鉀緩沖液，在15。C，100rpm下振蕩20h。然后用20ml磷酸鉀緩沖液(100mM，pH7.0)沖洗干凈，并借助真空泵抽干水分，獲得固定化VHb。5.2、固定化HDAO的制備選取5種環(huán)氧型載體SepabeadsEXE16，SepabeadsEc-Ep，EupergitC，EupergitCM和Amberzymeoxiraneresin，按照每300mg蛋白使用lg載體的比例，分別投入HDAO(6.3mg/ml)的純酶液中，處理方法與以上5.1的VHb相同，獲得固定化HDAO。5.3、固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)的制備選用Amberzymeoxiraneresin,GOD和AOD溶液的濃度均為2mg/ml。按照每20mg蛋白使用lg載體的比例將載體投入各純酶液中，處理方法與與以上5.1的VHb相同，獲得固定化GOD和AOD。實(shí)施例6、VHb對(duì)于黃素氧化酶催化活性的影響6.1、VHb對(duì)固定化HDAO活力影響首先對(duì)DAO催化反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行說(shuō)明，反應(yīng)器容積約50ml，自身有恒溫裝置，頂端安裝有一個(gè)攪拌槳，底部有砂芯漏斗，外接一個(gè)進(jìn)氣管。分別取固定化的和游離的VHb作為助催化劑逐漸加入固定化DAO的催化反應(yīng)體系中，從酶反應(yīng)器底部通入空氣(30ml/min)，分別在2min和10min時(shí)取樣測(cè)定固定化DAO的活力。具體測(cè)定方法如下取0.3克固定化DAO，加入15ml4%CPC溶液(用pH7.5，0.1M磷酸鈉緩沖液配制，用3mol/L氨水調(diào)節(jié)pH7.25)，循環(huán)水浴保溫2(TC，400rpm攪拌，通入空氣30ml/min，轉(zhuǎn)化過(guò)程中用3mol/L氨水維持pH7.25。分別在2min和lOmin時(shí)用微量進(jìn)樣器取出20^反應(yīng)的樣品，加入20nl酸終止液，再加入960^U重蒸水，12000rpm離心5min，上清進(jìn)行HPLC測(cè)定，HPLC的具體條件如下流動(dòng)相乙腈甲醇1.29%(v/v)乙酸=7.5:15:77.5;流速lml/min;波長(zhǎng)260nm;柱子AZORBAXEclipseXDB-C8(4.6X150nm，Agilent,USA)。酶活力定義1個(gè)單位(U)DAO酶活力定義為每分鐘產(chǎn)生的酮酸和GL-7-ACA微摩爾數(shù)之和所需要的酶量。添加固定化VHb的固定化HDAO的活力測(cè)定結(jié)果如圖3所示，當(dāng)固定化VHb加入質(zhì)量為50mg時(shí)，此時(shí)固定化HDAO活力是對(duì)照(未添加VHb)的1.7倍，當(dāng)固定化VHb質(zhì)量增加至300mg時(shí)，固定化HDAO活力是對(duì)照的2倍。添加游離VHb的HDAO的活力測(cè)定結(jié)果如圖4所示，當(dāng)添加游離VHb的質(zhì)量從0.05增加至l.Omg時(shí)，固定化HDAO活力持續(xù)增加，當(dāng)加入l.Omg游離VHb后，HDAO固定化酶活力與對(duì)照(未添加VHb)相比增加了3倍。可見(jiàn)，不管是游離的還是固定化的VHb，作為助催化劑都可以明顯提高DAO的催化氧化活性。6.2、VHb對(duì)固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)活力影響首先對(duì)固定化GOD和固定化AOD催化反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行說(shuō)明反應(yīng)器容積約50ml，自身有恒溫裝置，頂端安裝有一個(gè)攪拌槳，底部有砂芯漏斗，外接一個(gè)進(jìn)氣管。分別取游離的和固定化的VHb作為助催化劑逐漸加入固定化GOD和固定化AOD的催化反應(yīng)體系中，從反應(yīng)器底部通入氮?dú)?2ml/min)，反應(yīng)10min取樣測(cè)定固定化GOD和固定化AOD活力。具體測(cè)定方法如下固定化GOD活力測(cè)定取5ml溶液A(將3.5mg辣根過(guò)氧化物酶與3.5mg4-氨基安替吡啉溶于20ml的0.2M，pH7.0磷酸鈉緩沖液中，加入3%苯酚溶液lml)與5ml溶液B(0.36mol/L葡萄糖溶液)混勻，在2(TC保溫5min，加入固定化GOD，反應(yīng)10min后取樣測(cè)定OD5(M)nm變化值。酶活力定義1個(gè)單位(U)GOD活力定義為每分鐘消耗1微摩爾葡萄糖所需要的酶固定化AOD活力測(cè)定取5ml溶液A(將3.5mg辣根過(guò)氧化物酶與3.5mg4-氨基安替吡啉溶于20ml的0.2M,pH7.0磷酸鈉緩沖液中，加入3%苯酚溶液lml)與5ml溶液B(0.2moI/L甲醇溶液)混勻，在2(TC保溫5min,加入固定化AOD，反應(yīng)10min后取樣測(cè)定OD鄉(xiāng)細(xì)變化值。酶活力定義1個(gè)單位(U)AOD活力定義為每分鐘消耗1微摩爾甲醇所需要的酶量。如圖5所示為添加游離VHb的GOD和AOD的活力測(cè)定結(jié)果，可見(jiàn)對(duì)于固定化GOD,當(dāng)加入0.5mg和l.Omg游離VHb后，GOD固定化酶活力分別是對(duì)照(未添加VHb)酶活力的1.4倍和1.6倍。同樣對(duì)于固定化AOD，當(dāng)加入VHb后，酶活力分別提高了L2倍和4倍。如圖6所示為添加固定化VHb的GOD和AOD的活力測(cè)定結(jié)果，可見(jiàn)在反應(yīng)體系中加入50mg和lOOmg固定化VHb，對(duì)于固定化GOD和AOD活力均有提高，當(dāng)加入lOOmg固定化VHb后，固定化GOD和AOD活力分別提高了0.8禾H1.5倍。雖然以上僅以固定化的D—氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶和醇氧化酶為材料，構(gòu)建出VHb和三角酵母DAO結(jié)合在一起所形成的融合蛋白HVDAO，并且將它們用于頭孢菌素C氧化的反應(yīng)體系，借以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了驗(yàn)證，但是根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)，將VHb用于提高其他種類(lèi)黃素氧化酶的活力，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。因此，將VHb