植物組織培養(yǎng)園藝

關(guān)于植物組織培養(yǎng)園藝22.1.1.2無菌操作室⒈功能⒉組成緩沖室（間）：接種室（間）：⒊無菌操作室的消毒⒋主要設(shè)備超凈工作臺金屬器械消毒器第2頁,共51頁，2024年2月25日，星期天32.1.1.3培養(yǎng)室功能主要設(shè)備環(huán)境條件

第3頁,共51頁，2024年2月25日，星期天42.1.1.4溫室功能第4頁,共51頁，2024年2月25日，星期天52.1.2組培實(shí)驗(yàn)室的布局

2.1.2.1布局基本要求便于隔離，便于操作，便于滅菌和便于觀察。

2.1.2.2基本布局規(guī)律根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作程序排列實(shí)驗(yàn)室；接種室和培養(yǎng)室設(shè)在與外界環(huán)境隔離性好的區(qū)域；滅菌室與接種室相鄰；其他實(shí)驗(yàn)室的布局可根據(jù)條件，以方便使用為宜。第5頁,共51頁，2024年2月25日，星期天6培養(yǎng)室準(zhǔn)備室滅菌室儲藏室接種室緩沖室植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖第6頁,共51頁，2024年2月25日，星期天72.1.2.3設(shè)計(jì)組培實(shí)驗(yàn)室時的注意事項(xiàng)為了減少污染，實(shí)驗(yàn)室最好設(shè)一走廊且走廊上方最好安裝紫外燈；培養(yǎng)室最好設(shè)在南面，設(shè)大玻璃窗，以雙層玻璃窗為最好。如果培養(yǎng)室是設(shè)在房屋的邊側(cè)，其東邊或西邊的墻上也可設(shè)置大玻璃窗；培養(yǎng)室房間及門要小，而且密閉性要好，最好裝移門；無菌操作室要小，要設(shè)緩沖間，也最好裝移門，且門要稍大一些。第7頁,共51頁，2024年2月25日，星期天82.1.3組培實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)備

2.1.3.1器皿和器械類⒈玻璃器皿⒉器械鑷子類解剖刀剪刀接種針細(xì)菌過濾器

第8頁,共51頁，2024年2月25日，星期天92.1.2.2儀器設(shè)備⒈無菌操作設(shè)備超凈工作臺第9頁,共51頁，2024年2月25日，星期天10高壓蒸汽滅菌器第10頁,共51頁，2024年2月25日，星期天11電熱烘箱接種器具消毒器第11頁,共51頁，2024年2月25日，星期天12⒉培養(yǎng)設(shè)備空調(diào)加濕器和去濕機(jī)定時器培養(yǎng)架搖床或旋轉(zhuǎn)床培養(yǎng)箱第12頁,共51頁，2024年2月25日，星期天13⒊藥品貯存和配制儀器設(shè)備冰箱天平酸度計(jì)⒋觀察分析儀器設(shè)備體視顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡倒置顯微鏡⒌其它儀器設(shè)備離心機(jī)恒溫水浴鍋第13頁,共51頁，2024年2月25日，星期天142.2培養(yǎng)基組培中培養(yǎng)基的重要性：基本培養(yǎng)基：指只含有維持離體植物細(xì)胞基本生命活動所需的營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基。通常包括水分、無機(jī)營養(yǎng)成分和有機(jī)營養(yǎng)成分，不包括激素和天然有機(jī)附加物。完全培養(yǎng)基：指在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另外附加激素或天然有機(jī)附加物所組成的培養(yǎng)基。第14頁,共51頁，2024年2月25日，星期天152.2.1培養(yǎng)基的構(gòu)成

2.2.1.1水

2.2.1.2無機(jī)鹽類大量元素化合物微量元素化合物

2.2.1.3有機(jī)營養(yǎng)成分糖類維生素類氨基酸類第15頁,共51頁，2024年2月25日，星期天162.2.1.4植物生長調(diào)節(jié)劑1、生長素類常用類型：NAA,2,4-D,IBA,IAA功能培養(yǎng)基中常用濃度：10-7～10-5mol/L或0.1～10mg/L第16頁,共51頁，2024年2月25日，星期天172、細(xì)胞分裂素類常用類型：6-BA,KT.TDZ,2-ip功能培養(yǎng)基中常用濃度：10-7～10-5mol/L或0.1～10mg/L第17頁,共51頁，2024年2月25日，星期天183、組織培養(yǎng)時，植物激素的使用規(guī)律在生長素存在的條件下，細(xì)胞分裂素的作用有加強(qiáng)的趨勢，但二者在使用上有一定的順序關(guān)系，處理順序不同，培養(yǎng)物的分化狀態(tài)也不同。規(guī)律如下：

⑴先用生長素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，有利于細(xì)胞分裂，但細(xì)胞不容易分化,容易產(chǎn)生多倍體細(xì)胞。

第18頁,共51頁，2024年2月25日，星期天19

⑵先用細(xì)胞分裂素處理，后用生長素處理，細(xì)胞分裂也分化。⑶用生長素和細(xì)胞分裂素同時處理，細(xì)胞脫分化后分化頻率提高。但二者的使用濃度比值可以決定器官分化方向：生長素/細(xì)胞分裂素比值高時，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值適中時，促進(jìn)愈傷組織的形成和生長。第19頁,共51頁，2024年2月25日，星期天202.2.1.5天然有機(jī)添加物質(zhì)椰汁：CM100～150ml/L酵母提取液：YE0.01%～0.5%番茄汁：5%～10%馬鈴薯汁：100g/L～200g/L香蕉泥（汁）：150mg/L～200mg/L第20頁,共51頁，2024年2月25日，星期天212.2.1.6培養(yǎng)基的pH值滅菌前pH值調(diào)控范圍：pH=5.7～5.8pH對培養(yǎng)基凝固的影響pH調(diào)節(jié)劑2.2.1.7凝固劑⒈瓊脂：用量范圍：3～10g/L影響瓊脂凝固的因素⒉Gelrite：植物凝膠2.2.1.8其他添加物活性炭（AC）、維生素C、抗生素等第21頁,共51頁，2024年2月25日，星期天222.2.2基本培養(yǎng)基的選擇

2.2.2.1基本培養(yǎng)基的類型⒈高無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基代表類型：MS，LS，BL，ER⒉硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基代表類型：B5，N6，SH⒊中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基代表類型：Nitsch，Miller，H⒋低無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基代表類型：White，WS，HE

第22頁,共51頁，2024年2月25日，星期天232.2.2.2基本培養(yǎng)基的選擇MS培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基改良的White培養(yǎng)基WPM培養(yǎng)基★培養(yǎng)基是否適合所培養(yǎng)的植物，必須通過試驗(yàn)進(jìn)行篩選。第23頁,共51頁，2024年2月25日，星期天242.2.3培養(yǎng)基的配制

母液稀釋法2.2.3.1培養(yǎng)基母液的配制和保存

1、基本培養(yǎng)基母液的配制

⑴單配法⑵混配法①按照避免難溶性沉淀形成的原則和物質(zhì)種類的不同，將基本培養(yǎng)基配方所包括的物質(zhì)進(jìn)行分組；第24頁,共51頁，2024年2月25日，星期天25

②基本培養(yǎng)基配方中物質(zhì)劃分組數(shù)的多少，即配制母液數(shù)的多少可根據(jù)實(shí)際情況而定，如MS培養(yǎng)基可以配制三液式、四液式、五液式等；例如：MS培養(yǎng)基五液式大量元素母液鈣鹽母液微量元素母液鐵鹽母液有機(jī)營養(yǎng)成分母液

第25頁,共51頁，2024年2月25日，星期天26

2、激素母液的配制⑴激素母液的濃度1～10mmol/L或0.1～1mg/L⑵配制方法生長素類細(xì)胞分裂素類⑶培養(yǎng)基的保存第26頁,共51頁，2024年2月25日，星期天27

2.2.3.2培養(yǎng)基的配制水準(zhǔn)備母液混合定容調(diào)pH加入瓊脂糖加熱溶解

培養(yǎng)器皿清洗干燥分裝封口高壓蒸汽滅菌冷卻凝固接種培養(yǎng)基具體配制操作過程：P21培養(yǎng)基配制程序第27頁,共51頁，2024年2月25日，星期天282.3組培實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)

2.3.1器皿和器具的洗滌P191.洗滌劑：無磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗潔精2.常用清洗方法洗滌劑清洗法超聲波清洗法

第28頁,共51頁，2024年2月25日，星期天293.玻璃器皿的清洗新購置的玻璃器皿的清洗用過的培養(yǎng)器皿的清洗已經(jīng)污染的玻璃器皿的清洗第29頁,共51頁，2024年2月25日，星期天302.3.2滅菌

2.3.2.1器具的滅菌方法干熱滅菌法高壓蒸汽滅菌法（濕熱滅菌法）火焰灼燒滅菌法

2.3.2.2培養(yǎng)基的滅菌方法高溫蒸汽滅菌法過濾除菌法第30頁,共51頁，2024年2月25日，星期天31培養(yǎng)基滅菌方法

-------濕熱滅菌法培養(yǎng)基濕熱滅菌最少時間

液體容積（ml）121℃所需時間（min）

20---50157520250---500251000301500---200035---40第31頁,共51頁，2024年2月25日，星期天32培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）操作P20

滅菌后培養(yǎng)基的存放：鍋內(nèi)加水放入消毒桶裝入培養(yǎng)基蓋好鍋蓋接通電源加熱排盡鍋內(nèi)冷空氣達(dá)到滅菌溫度時開始計(jì)時并保持足夠長的時間繼續(xù)加熱切斷電源壓力表指針歸零時打開鍋蓋取出培養(yǎng)基并存放好第32頁,共51頁，2024年2月25日，星期天33高壓蒸汽滅菌鍋安全使用注意事項(xiàng)：

①滅菌前外層鍋內(nèi)要加入足夠的水,滅菌完成后要將鍋內(nèi)的水排放干凈。②在滅菌過程中及滅菌后，壓力表壓力指針歸零之前,不能打開鍋蓋,以免發(fā)生危險。③注意日常維護(hù)和檢查,及時發(fā)現(xiàn)問題,及時修理，保證使用安全可靠。第33頁,共51頁，2024年2月25日，星期天34使用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行物品滅菌時的注意事項(xiàng)：

①消毒鍋內(nèi)放置的物品要有一定的縫隙，便于高溫蒸汽上下回流，達(dá)到良好滅菌效果。②鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡，否則壓力表的指針雖然達(dá)到了規(guī)定的壓力，但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在，并不能達(dá)到相應(yīng)的溫度，因而影響滅菌效果。③進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌時，鍋內(nèi)達(dá)到規(guī)定的滅菌溫度后，在嚴(yán)格保持滅菌溫度的同時，還要嚴(yán)格保持滅菌時間。時間過長會破壞培養(yǎng)基內(nèi)一些化學(xué)成分的有效性，時間過短則達(dá)不到滅菌效果。第34頁,共51頁，2024年2月25日，星期天35

2.3.2.3無菌操作室內(nèi)的滅菌方法熏蒸滅菌法射線滅菌法2.3.2.4外植體的表面滅菌P29化學(xué)消毒劑滅菌法抗生素抑菌法第35頁,共51頁，2024年2月25日，星期天36

1.外植體滅菌的常用殺菌劑

良好的外植體滅菌效果的含義：外植體滅菌后無菌率高，同時植物細(xì)胞不會受損傷或只是輕微受損傷而能保持正常生長。

第36頁,共51頁，2024年2月25日，星期天372.外植體表面滅菌外植體表面滅菌操作前的準(zhǔn)備工作：①無菌水、漂洗瓶、切割用器皿（玻璃培養(yǎng)皿或不銹鋼切割盤）和金屬器具均經(jīng)過高溫高壓滅菌并整齊擺放在超凈工作臺上。②滅菌劑配制好并整齊擺放在超凈工作臺上。第37頁,共51頁，2024年2月25日，星期天38第38頁,共51頁，2024年2月25日，星期天39外植體表面滅菌的一般過程預(yù)處理：外植體取材備用無菌水充分漂洗3～5次無菌條件下，消毒劑處理無菌條件下，70%酒精表面消毒30S～60S預(yù)處理第39頁,共51頁，2024年2月25日，星期天40

3.影響外植體消毒效果的因素：

①消毒劑種類②消毒劑使用濃度③消毒處理時間

4.培養(yǎng)過程中污染原因及對策污染的病原類型污染發(fā)生原因防污染對策第40頁,共51頁，2024年2月25日，星期天41

2.3.3外植體的接種

1定義

2外植體接種操作前的準(zhǔn)備工作接種室的清潔和滅菌超凈工作臺的清潔和滅菌準(zhǔn)備操作人員無菌操作前的準(zhǔn)備

3外植體接種的具體步驟切割外植體培養(yǎng)瓶傾斜靠近酒精燈火焰瓶蓋外部在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒數(shù)秒鐘旋開瓶蓋，扣放在酒精燈旁邊瓶口在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒數(shù)秒鐘用無菌鑷子將外植體均勻放置在培養(yǎng)基上瓶蓋在火焰上灼燒兩圈蓋緊瓶蓋第41頁,共51頁，2024年2月25日，星期天42第42頁,共51頁，2024年2月25日，星期天43第43頁,共51頁，2024年2月25日，星期天44第44頁,共51頁，2024年2月25日，星期天452.4

離體培養(yǎng)體系的建立供體植物材料的確定外植體的選擇外植體的滅菌外植體的培養(yǎng)外植體的接種第45頁,共51頁，2024年2月25日，星期天462.4.1供體植物材料的來源