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第34章
DNA的復(fù)制和修復(fù)DNAReplicationandRepairDNAReplication第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
DNA復(fù)制
DNA修復(fù)合成
反轉(zhuǎn)錄DNA的體外復(fù)制:分子克?。≒CR)。DNA生物合成第一節(jié)
DNA的生物合成DNA生物合成的方式:第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(一).DNA半保留復(fù)制
1953年,Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí),就推測(cè)DNA可能按照半保留機(jī)制進(jìn)行自我復(fù)制。
1、半保留復(fù)制(semiconservativereplication):
定義:DNA復(fù)制的一種方式,每條鏈都可用作合成互補(bǔ)鏈的模板,合成出兩分子的雙鏈DNA,每個(gè)分子都是由一條親代鏈和一條新合成的鏈組成。P408DNA復(fù)制具有兩個(gè)特點(diǎn):(半保留復(fù)制)和(半不連續(xù)復(fù)制)
一、DNA復(fù)制第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-彌散式possiblecopyingmechanismOFDNADNA復(fù)制方式有三種可能性:全保留、半保留和分散式。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
2.
DNA半保留復(fù)制的證明(兩個(gè))(1)
密度梯度離心
(重同位素標(biāo)記)1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA標(biāo)記,同時(shí)可以否定另外兩種復(fù)制方式第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-密度梯度離心第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(2)
放射性同位素自顯影?
1963年,Cairns設(shè)計(jì)了一個(gè)更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)—放射自顯影的方法,進(jìn)一步證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制;?
1957年,Taylor的實(shí)驗(yàn)證明,在真核生物中,DNA的復(fù)制也是半保留的 B:(雙鏈標(biāo)記)A和C:(單鏈標(biāo)記)H3-標(biāo)記的脫氧胸苷第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-?
單鏈DNA首先復(fù)制合成雙鏈的復(fù)制型(單鏈DNA復(fù)制時(shí),通常先形成雙鏈復(fù)制型,再進(jìn)行半保留復(fù)制)。
無(wú)論是復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄,在形成雙鏈螺旋分子時(shí)都是通過(guò)堿基配對(duì)來(lái)完成的。半保留復(fù)制非常普遍第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
DNA半保留復(fù)制的意義
意義:按半保留復(fù)制方式,子代DNA與親代DNA的堿基序列一致,子代保留了親代的全部遺傳信息,體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ),但是相對(duì)的。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)證明DNA是半保留復(fù)制
-2012大連理工大學(xué)生物化學(xué)2.
豬流感病毒HRN1是反轉(zhuǎn)錄病毒,試想出實(shí)驗(yàn)方案以阻止病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而不影響細(xì)胞內(nèi)DNA正常復(fù)制
-2012山東大學(xué)生物化學(xué)3.簡(jiǎn)述MettewMeselson和FranklinStahl設(shè)計(jì)了一個(gè)什么樣的實(shí)驗(yàn),證實(shí)DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制思考題華東師范大學(xué)2007年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題2010年南開大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(二)、半不連續(xù)復(fù)制(P418)(1)DNA聚合酶只能在5`→3`方向延長(zhǎng)DNA(2)DNA是反向雙螺旋
DNA聚合酶如何同時(shí)完成2條鏈的復(fù)制?
第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-半不連續(xù)復(fù)制
定義:
DNA一條鏈連續(xù)合成和另一條鏈不連續(xù)合成的復(fù)制方式,稱為DNA的半不連續(xù)復(fù)制。DNA聚合酶只能按5‘→3’方向催化合成DNA,不能催化3‘—5’方向合成,領(lǐng)頭鏈隨從鏈岡崎片段:引物第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-半不連續(xù)復(fù)制(續(xù)1)
領(lǐng)頭鏈:對(duì)應(yīng)3’—5‘的模板鏈,順著解鏈方向生成的子鏈,復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的,這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。
隨從鏈:對(duì)應(yīng)5‘—3’的模板鏈,復(fù)制的方向與解鏈方向相反,復(fù)制不是連續(xù)延長(zhǎng),這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈。
岡崎片段:隨從鏈中不連續(xù)的DNA片段稱為岡崎片段。
原核生物:
1000~2000個(gè)核苷酸,相當(dāng)于一個(gè)順?lè)醋诱婧松?
100~200個(gè)核苷酸(相當(dāng)一個(gè)核小體)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題1.
是非判斷題
DNA分子是由兩條鏈組成,其中一條鏈作為前導(dǎo)鏈的模板,另一條鏈作為后隨鏈的模板。
廈門大學(xué)2005年生物化學(xué)前導(dǎo)鏈和滯后鏈?zhǔn)轻槍?duì)某個(gè)復(fù)制叉而言的第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
思考題(1)如何證明岡崎片斷的存在?(2)最初對(duì)岡崎片斷測(cè)定的實(shí)驗(yàn)表明,其數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)新合成
DNA的一半,好象兩條鏈都是不連續(xù)的,試分析原因?提示:(1)同位素標(biāo)記dNTP,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后終止合成,檢查發(fā)現(xiàn)標(biāo)記出現(xiàn)在小片段DNA上,且小片段
DNA分子量相同,數(shù)量較多。
(2)前導(dǎo)鏈會(huì)少量的dUMP摻入,后尿嘧啶堿基被切除形成AP位點(diǎn),后該處磷酸二酯鍵打斷,部分核苷酸,水解,造成一個(gè)缺口,后被修復(fù),該過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一些類似岡崎片斷的DNA片段。P418第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成:dUTP一旦形成就被轉(zhuǎn)化成dUMP
?dUTPase活性高低的影響?DNA復(fù)制DNA復(fù)制X第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-UUAAUUAA
解釋糖苷酶(ung)+其他酶U等被切除(如果糖苷酶失活ung-,結(jié)果會(huì)如何?)判斷:DNA聚合酶可以利用dUTP做底物。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
解釋UUdenature
糖苷酶-
ung–
dump片段越長(zhǎng),大約有一半的新生DNA為被脈沖標(biāo)記的岡奇片段AA
dut
–
dump片段越短dUTPase
DNA沒(méi)有U!第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
解釋E.colidUTPase,它能使
dUTP變成dUMP,dUMP是不能作為DNA合成的底物,這樣它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶(uracilN-glycosylase),它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵,形成無(wú)Pu和Py位點(diǎn)(apurinicorapyrimidinic,AP),再由AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)切出一個(gè)缺口,進(jìn)一步進(jìn)行切除修復(fù)。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-解釋(1)在dut-突變體(
dUTPase缺失)中岡崎片段比在dut+中為短。這是因?yàn)閁摻入機(jī)會(huì)增加;(2)在
ung-
(尿嘧啶N-糖苷酶缺失)突變體中,新合成的DNA約有一半由片段組成。(3)
因?yàn)槟蜞奏-糖苷酶缺失,不會(huì)切除U的糖苷鏈,也就不會(huì)出現(xiàn)AP位點(diǎn),所以堿沉淀時(shí)不易斷裂,從而保持了半不連續(xù)的原貌。在dut-,ung-雙突變體中,結(jié)果和實(shí)驗(yàn)(2)相同,更進(jìn)一步證實(shí)了此推測(cè)。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題1.細(xì)胞DNA復(fù)制是半不連續(xù)的,這是因?yàn)椋?/p>
A.DNA聚合酶只能從3→5合成DNA鏈
B.模板雙鏈?zhǔn)欠雌叫械?/p>
C.DNA聚合酶只能一個(gè)一個(gè)地加接核苷酸殘基
D.DNA酶法合成是個(gè)自發(fā)過(guò)程
南開大學(xué)2006年生物化學(xué)2.論述半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制的過(guò)程
2011年天津大學(xué)生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題3.
DNA是以半保留方式進(jìn)行復(fù)制的,如果放射性全標(biāo)記的雙鏈DNA分子在無(wú)放射性標(biāo)記的溶液中經(jīng)兩次復(fù)制,那么所產(chǎn)生的4個(gè)DNA分子其放射性狀況如何?A、兩個(gè)分子含有放射性;
B、全部含有放射性;C、雙鏈中各有一半含有放射性;D、所有分子的兩條鏈都沒(méi)有放射性。
華南理工大學(xué)2006年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題3.
DNA復(fù)制時(shí)候后隨鏈?zhǔn)菍槠危瑸槭裁辞皩?dǎo)鏈也是小片段
山東大學(xué)2010年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-二、DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方式
復(fù)制子:基因組中可以獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位,它包括DNA每條鏈的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)序列,可能還有一些終止序列。(復(fù)制在起始階段進(jìn)行調(diào)控,一旦起始,將復(fù)制下去,直到完成)1、原核生物和病毒為單復(fù)制子,真核生物為多復(fù)制子P408第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題
岡崎片段不是一個(gè)復(fù)制子,其起點(diǎn)也非復(fù)制起點(diǎn)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
復(fù)制的類型和方式
復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的(等速進(jìn)行或異速進(jìn)行),形成兩個(gè)復(fù)制叉,少數(shù)是單向復(fù)制,形成一個(gè)復(fù)制叉。(1)、直線雙向復(fù)制
單點(diǎn)雙向:T7
多點(diǎn)雙向:真核染色體DNA(2)、θ型復(fù)制:環(huán)狀雙鏈DNA,單向或雙向(E.coli.)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
復(fù)制的類型和方式第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
首先將E.coli染色體,切成1%染色體長(zhǎng)度的片段,分別進(jìn)行(分子雜交),后放射自顯影大腸桿菌OriC在liv位點(diǎn)P409
大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn):OriC(originof
Chromosomalreplication)2、復(fù)制往往具有一定的起點(diǎn)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
復(fù)制的方向判斷
先低放射性再高放射性(3H-脫氧胸苷)P409第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制起點(diǎn)的特點(diǎn)(1)復(fù)制起點(diǎn)較保守富含AT,含一些反向重復(fù)序列(2)兩條鏈復(fù)制起點(diǎn)可以在不同的點(diǎn)上(如:D-環(huán)復(fù)制)(3)DNA復(fù)制的控制在起點(diǎn)控制,復(fù)制的速度決定于起始頻率(延伸的速度比較恒定,不決定于培養(yǎng)基狀況)DNA鏈的呼吸作用:DNA(復(fù)制原點(diǎn)處)氫鍵迅速斷裂與再生,導(dǎo)致兩條DNA鏈不斷解鏈與聚合,形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過(guò)程。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-判斷題1.通常DNA復(fù)制終止時(shí)并不需要特定的信號(hào)。(×)
中山大學(xué)2002年生物化學(xué)試題2.
真核生物DNA復(fù)制起點(diǎn)的序列專一性要低于細(xì)菌和病毒(×).思考題第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-特殊的復(fù)制方式—滾環(huán)復(fù)制?
主要發(fā)生在病毒中,細(xì)菌F因子(Ffactor);如φX174噬菌體
(單向復(fù)制?)?
在正鏈DNA上打開一個(gè)切口;?
以切口的3’-端為引物開始合成環(huán)鏈DNA的互補(bǔ)鏈,取代開環(huán)的鏈;3’-OHP410第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-滾環(huán)復(fù)制NOTE:cangetsingleunitgenomesormultimericcopies
單向復(fù)制
第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-復(fù)制的類型和方式—滾環(huán)復(fù)制E.coliphage(噬菌體):ΦX174“Template“rolls”,extrudesleadingstrandOkazakifragsmadeonleadingstrandasitemerges.
單向復(fù)制
?第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
特殊的復(fù)制方式-D環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制:
線粒體、葉綠體DNA(不對(duì)稱復(fù)制,兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)不在同一點(diǎn)上,一條鏈先復(fù)制,另一條鏈保持單鏈而被取代:當(dāng)一條鏈復(fù)制到一定程度時(shí)才暴露出另一條鏈的復(fù)制起點(diǎn),另一條鏈才開始復(fù)制,
(單向復(fù)制,全連續(xù)復(fù)制,沒(méi)有岡崎片段)
第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-?D-環(huán)擴(kuò)充越過(guò)被取代鏈的復(fù)制起點(diǎn);?被取代鏈啟動(dòng)復(fù)制,方向與第一條鏈相反;?兩條鏈的合成沒(méi)有岡崎片斷單向復(fù)制,全連續(xù)復(fù)制
特殊的復(fù)制方式-D環(huán)復(fù)制第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
特殊的復(fù)制方式-2D環(huán)復(fù)制葉綠體DNA第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-復(fù)制的類型和方式—多復(fù)制叉復(fù)制
第一輪復(fù)制尚未完成,復(fù)制起點(diǎn)就開始第二輪的復(fù)制。
DNA復(fù)制時(shí)復(fù)制叉前進(jìn)的速率比較恒定,DNA復(fù)制的速率實(shí)際上取決于起始頻率。
E.coli復(fù)制叉移動(dòng)的速率約50Kb/min,復(fù)制一代約需40分鐘[4.2X106/(50KbX2)=42]。富營(yíng)養(yǎng)時(shí),可采取多復(fù)制叉復(fù)制方式,結(jié)果20min可以復(fù)制一代。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
真核生物DNA的復(fù)制
真核復(fù)制叉前進(jìn)的速率約1000-3000bp/min,采用多復(fù)制子方式,真核染色體復(fù)制一代要6-8小時(shí)。
1.一條染色體上具有多個(gè)復(fù)制子,同一染色體上,各復(fù)制子長(zhǎng)度不同。2.不同生長(zhǎng)期,復(fù)制子數(shù)目不同。如果蠅,生長(zhǎng)旺盛期,細(xì)胞快速分裂,復(fù)制子數(shù)目可擴(kuò)增十倍。3.每個(gè)復(fù)制起點(diǎn)在每個(gè)復(fù)制周期中只啟動(dòng)一次。4.
相鄰復(fù)制子的終點(diǎn)是隨機(jī)碰撞會(huì)合的。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1.已知大腸桿菌在37攝氏度時(shí)雙向復(fù)制一次約需40分鐘,但在這些培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)菌分裂可達(dá)20分鐘一次,為什么?
中山大學(xué)2000年生物化學(xué)試題思考題2、名詞解釋:滾環(huán)復(fù)制2013山東大學(xué)3、判斷:滾環(huán)復(fù)制是噬菌體DNA
在細(xì)菌中最常用的一種復(fù)制方式2008南京大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-4、滾滾環(huán)復(fù)制(BDE)
A、是細(xì)胞DNA的主要復(fù)制方式。
B、可以使復(fù)制子大量擴(kuò)增。
C、產(chǎn)生的復(fù)制子總是雙鏈環(huán)狀拷貝。
D、是噬菌體DNA在細(xì)菌中最通常的一種復(fù)制方式。
E、復(fù)制子中編碼切口蛋白的基因的表達(dá)是自動(dòng)調(diào)節(jié)的思考題第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-三、
DNA復(fù)制有關(guān)的酶及蛋白質(zhì)因子底物:dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):提供3`-OH末端(體內(nèi)為RNA,體外為DNA,如PCR反應(yīng))酶及蛋白質(zhì)因子DNA聚合酶:依賴DNA的DNA聚合酶解鏈(解旋酶)類,單鏈結(jié)合蛋白引物酶,拓?fù)洚悩?gòu)酶
DNA連接酶(P410)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
需4種dNTP(不是dNDP、dNMP、NTP)需DNA模板
需引物
(DNA、RNA)
5`→3`方向越長(zhǎng)
(化學(xué)合成方向與此相反)
P413DNA聚合反應(yīng)和聚合酶
DNA+dNTP=DNA(n+1)+PPi第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-āαDNA聚合酶反應(yīng)的特點(diǎn)
DNA+dNTP=DNA-dNMP
+PPiɑ-磷酸dNTP第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題1.一個(gè)同學(xué)想研究DNA復(fù)制過(guò)程用放射性磷來(lái)標(biāo)記底物,他標(biāo)記的磷是第3位的磷,問(wèn)是否能夠達(dá)到目的。
2012年山東大學(xué)生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題2.
用放射性磷元素標(biāo)記dNTP的ɑ-磷酸,參與DNA合成,分離后用檢測(cè)其放射性以確定在合成過(guò)程中標(biāo)記核苷酸摻入的量1)、這一過(guò)程的化學(xué)原理2)、如只標(biāo)記一種dNTP放射性檢測(cè)結(jié)果會(huì)有什么不同3)、如果在加入時(shí)不小心漏加了一種核苷酸,對(duì)放射性的影響4)、如標(biāo)記其它位置的磷元素結(jié)果如何。
2012年山東大學(xué)生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
2.
大腸桿菌的DNA聚合酶DNA聚合酶:
DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA-polⅣDNA-polⅤ
依賴DNA的DNA聚合酶(DNAdependentDNApolymerase)或DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(DNA-directedDNApolymerase),均縮寫為DDDP。(P414)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
(1).大腸桿菌的DNA聚合酶
I
單鏈球狀蛋白,含鋅原子,多功能酶。①5`→
3`DNA聚合酶活力(使DNA鏈從5→3方向延長(zhǎng))②3→
5
核酸外切酶活力,起校正功能;③5→
3
核酸外切酶活力,切除引物或修復(fù)由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體;④聚合反應(yīng)的逆反應(yīng)(由3`端焦磷酸解)
DNA+dNTP=DNA-dNMP
+PPi第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
DNA復(fù)制過(guò)程中堿基對(duì)受雙重校對(duì)(DNA聚合酶選擇作用)(3`→5`外切酶的校對(duì)作用)DNA聚合酶的右手裝結(jié)構(gòu)沒(méi)有校對(duì)作用的錯(cuò)誤率:10-5,有校對(duì)作用的錯(cuò)誤率5x10-7第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
3'→5'外切酶活性——校對(duì)作用某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實(shí)性降低,而易發(fā)生突變,從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低,起著促突變因子的作用。相反,另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多,因此,其DNA復(fù)制真實(shí)性好,變異率低??梢?,3'→5'外切酶活性對(duì)DNA復(fù)制真實(shí)性的維持是十分重要的。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA聚合酶I的部分水解DNA-polⅠ木瓜蛋白酶N端C端小片段大片段/Klenow片段
53核酸外切酶活性
DNA聚合酶活性35
核酸外切酶活性(P414)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA聚合酶
I的特點(diǎn)
Klenow片段(Klenowfragment):
E.coliDNA聚合酶I經(jīng)部分水解生成的C末端605個(gè)氨基酸殘基片段。該片段保留了DNA聚合酶I的5`-3`聚合酶和3`-5`外切酶活性,
Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA,進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。
Sanger法(雙脫氧非)DNA測(cè)序中使用Klenow片段優(yōu)于全酶?最好使用沒(méi)有校對(duì)活性的酶?第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA聚合酶I的功能
遺傳學(xué)分析表明DNA聚合酶I復(fù)制速度慢,持續(xù)合成能力差,不是主要的復(fù)制酶,主要是參與引物切成或DNA的損傷修復(fù)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(2).大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅱ
5′→3’聚合酶活性
3’→5′外切酶活性
無(wú)5’→3’外切酶活性它只是在無(wú)polI及polⅢ的情況下才起作用,其真正的功能也未完全清楚,可能在損傷修復(fù)中有特殊作用。在DNA聚合酶
I活性低的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn),多亞基第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
(3).大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅲ①結(jié)構(gòu)特點(diǎn):含鋅原子
由10種亞基組成不對(duì)稱異源二聚體。核心酶(αεθ)
α亞基:5′→3′聚合酶活性
ε亞基:3′→5′外切酶活性和
堿基選擇功能,是復(fù)制保真性所必需
θ亞基:可能起組裝作用β亞基:夾穩(wěn)模板鏈并使酶沿模板鏈滑動(dòng),維持進(jìn)行性γ-復(fù)合物:促進(jìn)全酶組裝至模板及增強(qiáng)核心酶活性EpsilonTheta第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA聚合酶Ⅲ全酶功能:原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-大腸桿菌的三種DNA聚合酶小節(jié)催化DNA聚合,主要復(fù)制酶參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞1011亞基數(shù)--+5
外切酶活性+++
5
外切酶活性+++5
聚合酶活性polIIIpolIIpolI突變后的致死性
可能?可能P414第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(4)大腸桿菌DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ.
新近發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ,參與易錯(cuò)鏈的修復(fù)。polIV:(encodedbydinBgene)
a)SOSrepairenzymeofdamagedDNApolV:(encodedbyumuD’2Cgene)a)SOSrepairenzymeofdamagedDNA第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
連接DNA鏈3
-OH末端和相鄰
DNA鏈5
-P末端,形成磷酸二酯鍵,從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應(yīng)需要提供能量
能量:細(xì)菌的連接酶利用NAD+。
能量:動(dòng)物和噬菌體的連接酶利用ATPP4173.
DNA連接酶(DNAligase)
第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-酶ATP(或NAD+)+酶ConnecttwoadjacentssDNAstrandsbyjoiningthe3′-OHofoneDNAstrandtothe5′-PofanotherDNAstrand.
DNA連接酶過(guò)程
P417共價(jià)催化共價(jià)的酶-AMP中間物第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-ThereactioncatalyzedbyDNAligase(1)NAD+或ATP將其腺苷?;D(zhuǎn)移到DNA連接酶的一個(gè)賴氨酸殘基的ε─氨基上形成共價(jià)的酶-AMP中間物,同時(shí)釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)或焦磷酸;(2)將酶-腺苷酸中間物上的AMP再轉(zhuǎn)移到DNA的5'-磷酸基端,形成一個(gè)焦磷酰衍生物,即DNA-腺苷酸;(3)被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH端反應(yīng)合成磷酸二酯鍵,同時(shí)釋放出AMP。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
細(xì)菌的連接酶只能連接堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上雙鏈中的單鏈缺口,不能連接單獨(dú)存在的DNA或RNA單鏈。若DNA兩股都有單鏈切口,只要缺口前后堿基互補(bǔ)也可連接
DNA連接酶在復(fù)制、DNA修復(fù)、重組、剪接中均起縫合缺口作用,是重要的工具酶之一。
DNA連接酶
第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-4.
引物酶
(primerase)(P419)
前導(dǎo)鏈只需要一個(gè)引物,滯后鏈需要多個(gè)引物引物為一小段RNA第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
引物酶(primerase)
DNA聚合酶不能發(fā)動(dòng)新鏈的起始,只能催化鏈的延伸-DNA合成需要引物,復(fù)制的引物為一小段RNA,岡崎片斷的5’末端連接有小段RNA做引物,以提供自由的3’-OH,使子代DNA鏈能夠開始聚合。
∴(1)DNA合成除需要dNTP外,還需要(NTP)-引物需要,引物為RNA
(2)DNA復(fù)制需RNA聚合酶-(引物合成酶),一種依賴DNA的RNA聚合酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-引物酶
?
引物酶對(duì)RNA聚合酶抑制劑不敏感,對(duì)利福平不敏感?引物酶,本身無(wú)活性,需組裝成引發(fā)體才能催化RNA引物的合成。大腸桿菌的引物酶:DnaG
合成引物50-100nt(長(zhǎng))真核生物的引物酶:DNA聚合酶a
合成引物10nt左右第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
DNA復(fù)制為什么要用引物?(為什么DNA聚合酶要用引物,RNA聚合酶不需要引物?為什么引物為RNA?)
⑴從模板復(fù)制最初幾個(gè)核酸時(shí),堿基堆集力和氫鍵都較弱,易發(fā)生錯(cuò)配
⑵新復(fù)制的最初幾個(gè)核苷酸,沒(méi)有與模板形成穩(wěn)定雙鏈,DNA聚合酶的3,→5,校對(duì)功能難發(fā)揮作用。
為什么需要引物第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-5.DNA復(fù)制的拓?fù)洚悩?gòu)性質(zhì)UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion
天然DNA存在著負(fù)超螺旋,這對(duì)于DNA分子的解旋非常由利。但隨著復(fù)制的進(jìn)行,復(fù)制叉前方的親代DNA會(huì)形成正超螺旋,然會(huì)積累巨大的張力,這種張力主要是通過(guò)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶作用消除的。P419第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的拓?fù)洚悩?gòu)性質(zhì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ:(與轉(zhuǎn)錄有關(guān))切斷DNA雙鏈中一股鏈,使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié);適當(dāng)時(shí)候封閉切口,DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。每一次催化作用可消除一個(gè)負(fù)超螺旋,L值增加1.反應(yīng)不需ATP拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ:(與復(fù)制有關(guān))切斷DNA分子兩股鏈,斷端通過(guò)切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能,連接斷端,DNA分子引入負(fù)超螺旋狀態(tài)。每次催化作用使L減少2,又稱促旋酶。(DNAtopoisomerase)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-TypeItopoisomerases共價(jià)催化第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-TypeItopoisomerases共價(jià)催化第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-細(xì)菌中的旋轉(zhuǎn)酶細(xì)菌中稱為旋轉(zhuǎn)酶(gyrase),屬于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ引入負(fù)超螺旋狀態(tài)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-Topoisomerasesasdrugtargets:
BecausedividingcellsrequiregreatertopoisomeraseactivityduetoincreasedDNAsynthesis,topoisomeraseinhibitorsareusedaschemotherapeuticagents.Camptothecin(喜樹堿)--TopoIinhibitorDoxorubicin(阿霉素或多柔比星)--TopoIIinhibitor
ThesedrugsactbystablilzingtheDNA-Topoisomerasecomplex.Also,someantibioticsareinhibitorsofthebacterial-specifictoposisomeraseDNAgyrasee.g.ciprofloxacin喹諾酮類
殺菌與抗癌第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-6.
DNA解螺旋酶(解旋酶,解鏈酶)?
解鏈酶依賴于單鏈DNA,對(duì)單鏈DNA親和力強(qiáng)?
解旋過(guò)程消耗ATP:2ATP/bp;具有ATPase活性
DnaB
蛋白在后隨鏈模板沿5’→3’移動(dòng);?
Rep蛋白或PriA
蛋白沿前導(dǎo)鏈模板
3’→5’移動(dòng)
DNA解螺旋酶(解旋酶)不是拓?fù)洚悩?gòu)酶,細(xì)菌中拓?fù)洚悩?gòu)酶稱為旋轉(zhuǎn)酶P421第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-7.單鏈DNA結(jié)合蛋白
四聚體的蛋白;與DNA單鏈發(fā)生結(jié)合;
結(jié)合具有協(xié)同效應(yīng)穩(wěn)定DNA解鏈后的單鏈狀態(tài),并保護(hù)核酸不被降解。使DNA的Tm下降真核生物中為Rp-A缺失會(huì)致死
SingleStrandDNABandingProtein(SSB)P421第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
四、原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程復(fù)制過(guò)程分為:起始,延伸,終止三個(gè)基本步驟P421(一).
DNA復(fù)制的起始(initiation)
E.coli的復(fù)制起點(diǎn)OriC是決定和控制E.coli染色體復(fù)制的唯一片段。大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(OriC)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
E.coli復(fù)制起始點(diǎn)—oriC的序列特征
E.coli的復(fù)制起點(diǎn)OriC中有二個(gè)復(fù)制必需區(qū)域:4個(gè)是9bp重復(fù)序列,能與起始蛋白DnaA特異結(jié)合,對(duì)于DNA復(fù)制的起始十分重要;3個(gè)是個(gè)連續(xù)出現(xiàn)的13bp序列,富含A和T,有利于雙螺旋DNA局部解旋并暴露兩條復(fù)制模板鏈。富含A和T第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-原核生物DNA復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)蛋白功能曾用名DnaA辨認(rèn)復(fù)制起點(diǎn)
DnaB結(jié)合于DnaA,
提供解旋酶活性解螺旋酶DnaC與DnaB形成復(fù)合體
DnaG合成引物
引物酶
HU刺激起始,促進(jìn)復(fù)合體形成
Gyrase解除正超螺旋,引入負(fù)超螺旋
旋轉(zhuǎn)酶
SSB穩(wěn)定單鏈DNA單鏈結(jié)合蛋白P422第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的起始DnaBDnaGDnaC引發(fā)體(DnaB+DnaG)+ATPHU前引發(fā)復(fù)合物負(fù)超螺旋第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的起始復(fù)制起始消耗ATP第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-復(fù)制的起始
復(fù)制的起始,要求DNA呈負(fù)超螺旋,這是因?yàn)镈naA只能與負(fù)超螺旋的DNA相結(jié)合,負(fù)超螺旋比正超螺旋有更好的模版作用。
復(fù)制的起始,要求起點(diǎn)附近的基因處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài),RNA聚合酶對(duì)復(fù)制起始的作用,可能是因?yàn)槠湓谄鹗键c(diǎn)附近合成一段RNA,形成RNA突環(huán),影響起點(diǎn)的結(jié)構(gòu),因而有利于DnaA的作用.第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DNA復(fù)制唯一一個(gè)受到調(diào)節(jié)的階段為起始階段,DNA的甲基化與細(xì)菌質(zhì)膜的的作用可以影響復(fù)制起始的時(shí)間,DNA復(fù)制的發(fā)動(dòng)與DNA甲基化和細(xì)菌質(zhì)膜有關(guān)。大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)叫oriC,由245bp構(gòu)成,在oriC中有11個(gè)含4bp的回文序列“GATC”,Dam甲基化酶可使該序列中的A第6位N甲基化。
細(xì)菌DNA的復(fù)制調(diào)控發(fā)生在起始階段P422第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
細(xì)菌DNA的復(fù)制調(diào)控發(fā)生在起始階段oriC
的11個(gè)回文序列
半甲基化DNA不啟動(dòng)復(fù)制,因?yàn)閛riC與膜結(jié)合DNA全部復(fù)制完并延遲一定時(shí)間后,子鏈DNA被甲基化新一輪復(fù)制第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
2.復(fù)制的延伸DNA聚合酶IIIDNA聚合酶IIIDNA聚合酶III引物引物引物前導(dǎo)鏈:DNA旋轉(zhuǎn)酶,解螺旋酶,SSB,DNA聚合酶Ⅲ,焦磷酸酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
復(fù)制的延伸
前導(dǎo)鏈
(leadingstrand):以一條鏈(3′5′)為模板時(shí),子代鏈的合成方向是5′3′,由引物酶在原點(diǎn)合成一條短RNA鏈,DNA多聚酶III結(jié)合于引物并加接脫氧核糖核苷酸殘基一旦合成開始,前導(dǎo)鏈的合成便連續(xù)地進(jìn)行,緊跟著復(fù)制叉移動(dòng),合成是連續(xù)的.
隨后鏈
(laggingstrand):
以另一條親代鏈(5′3′)為模板時(shí),子代鏈的合成方向5′3′滯后鏈的合成是不連續(xù)的以短的岡崎片斷的形式完成的,每合成一個(gè)岡崎片段都需起始一次,由引物酶合成一個(gè)引物.
第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
前導(dǎo)鏈合成一個(gè)引物,滯后鏈則合成許多岡崎片段的引物。在同一復(fù)制叉上,引物的合成前導(dǎo)鏈早于滯后鏈。引物第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-引物?
是短鏈RNA。(體外為PCR中DNA)?
長(zhǎng)度一般:原核生物,10-60bp(長(zhǎng))真核生物,2-10bp(哺乳動(dòng)物)
前導(dǎo)鏈引物長(zhǎng)于滯后鏈岡崎片段引物?合成方向是5'→3'方向。?提供的3‘-OH,可在DNA-polⅢ催化下,利用dNTP
生成磷酸二酯鍵。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-后隨鏈的模板在全酶上繞轉(zhuǎn)180.形成一個(gè)小環(huán)
原核同一個(gè)DNA聚合酶III以二聚體形式在同一時(shí)間分別進(jìn)行復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和滯后鏈。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-引發(fā)體(primosome)與引物合成
解鏈酶
DnaB有兩個(gè)功能,其一是解螺旋酶;另一是活化引物合成酶(DnaG),與DnaG引物合成酶構(gòu)成一個(gè)基本功能單位,稱為引發(fā)體(DnaB+DnaG),合成引物。在某些噬菌體DNA的復(fù)制過(guò)程中,引發(fā)體還包括一些輔助蛋白。P423第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的延伸
引發(fā)體方向移動(dòng)(與引物或?qū)槠魏铣傻姆较蛘孟喾?,而與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同),移到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-岡崎片段的連接
岡崎片段的連接:在DNA聚合酶Ⅰ的催化下,除去RNA引物,同時(shí)催化DNA片段繼續(xù)延長(zhǎng)至另一DNA片段的5'端,后在連接酶的催化下連接成完整的DNA分子。123第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-岡崎片段的連接切口平移DNA連接酶
DNApolIDNApolIIIDNApolIII
DNApolIDNA連接酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA切口平移所用的酶為()。A、Klenow酶,B、Taq酶,C、DNA聚合酶ID、DNA連接酶NickTranslation(自學(xué))切口平移中國(guó)科學(xué)院06年第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
拓?fù)洚悩?gòu)酶細(xì)菌領(lǐng)頭鏈和隨從鏈的延長(zhǎng)差異前導(dǎo)鏈:DNA旋轉(zhuǎn)酶,解螺旋酶,SSB,DNA聚合酶Ⅲ,焦磷酸酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-細(xì)菌領(lǐng)頭鏈和隨從鏈的延長(zhǎng)差異
前導(dǎo)鏈
滯后鏈前體dNTP:dATP,
dGTP,
dCTP,dTTPdNTP:dATP,dGTP,dCTP,dTTPNTP:ATP,GTP,CTP,UTP酶DNA旋轉(zhuǎn)酶,解螺旋酶,單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB),DNA聚合酶Ⅲ,焦磷酸酶DNA旋轉(zhuǎn)酶,解螺旋酶,單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB),DNA聚合酶Ⅲ,焦磷酸酶,引物酶,DNA聚合酶Ⅰ,DNA連接酶和NAD+復(fù)制延伸過(guò)程中的各種原料、酶或蛋白質(zhì)因子第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-)
復(fù)制體(replisome)
復(fù)制體:是在復(fù)制叉附近與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子,他們?cè)趶?fù)制叉上形成離散的復(fù)合物,彼此配合,進(jìn)行高度精確的復(fù)制,這種結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制體(DNApolⅢ二聚體、引發(fā)體和DnaB等)復(fù)制體的基本活動(dòng)包括:1)雙鏈的解開;2)RNA引物的合成;3)DNA鏈的延長(zhǎng);4)切除RNA引物,填補(bǔ)缺口,連接DNA片段;5)切除和修復(fù)錯(cuò)配堿基。P421第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-3.E.coliDNA合成的終止現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)終止區(qū)域
(terE,D,A
和terC,B,F),
位于相遇點(diǎn)的另一側(cè)100Kb
處。每一終止順序?qū)δ骋环较蛞苿?dòng)的復(fù)制叉來(lái)說(shuō)是特異的。終止需要Tus(36kD),
Tus能識(shí)別ter保守順序,并阻止復(fù)制叉繼續(xù)前進(jìn)。
ter-Tus復(fù)合物可能通過(guò)抑制螺旋酶來(lái)實(shí)行終止第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-E.coliDNA合成的終止
ThetwonewlysynthesizedcircularchromosomalDNAs
aretopologicallyinterlinked(catenated)andisfinally
separatedbytheactionofaTypeIIopoisomerases.
最后還有50-100bp通過(guò)修復(fù)方式填補(bǔ)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ(termination)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題1.在DNA復(fù)制過(guò)程中,兩條新鏈的合成為何一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)復(fù)制,另一條鏈?zhǔn)情g斷復(fù)制?并比較兩條新鏈合成過(guò)程的不同點(diǎn)。
天津醫(yī)科大學(xué)2006生物化學(xué)2.簡(jiǎn)述參與DNA復(fù)制的酶及基本過(guò)程復(fù)旦大學(xué)2003年考研生物化學(xué)3.細(xì)胞DNA復(fù)制是半不連續(xù)的,這是因?yàn)椋?/p>
A.DNA聚合酶只能從3→5合成DNA鏈B.模版雙鏈?zhǔn)欠雌叫械腃.DNA聚合酶只能一個(gè)一個(gè)地加接核苷酸殘基D.DNA酶法合成是個(gè)自發(fā)過(guò)程南開大學(xué)2006年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題4.
以下哪個(gè)過(guò)程不需要DNA連接酶?
(A)DNA復(fù)制(B)DNA修復(fù)(C)DNA重組
(D)制備重組DNA
(E)DNA修飾。5需要以RNA為引物的是:
(A)DNA復(fù)制(B)RNA轉(zhuǎn)錄
(C)轉(zhuǎn)錄
(D)蛋自質(zhì)合成(E)RNA復(fù)制
華東師范大學(xué)2006生物化學(xué)考研6.敘述DNA聚合酶I在大腸桿菌細(xì)胞DNA復(fù)制中的功能,并介紹這個(gè)酶在生物技術(shù)中的應(yīng)用。
南開大學(xué)2006年生物化學(xué)7.
原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程
中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)2011年生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題8.
關(guān)于DNA復(fù)制的敘述哪一項(xiàng)論述是錯(cuò)誤的?()
A.有DNA指導(dǎo)的RNA聚酶參加,B.有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶參加,C.為半保留復(fù)制D.有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶參加
山東大學(xué)2001生物化學(xué)9.在一個(gè)復(fù)制叉之中,以下哪一種蛋白質(zhì)的數(shù)量最多?()
(A)DNA聚合酶(B)引發(fā)酶(C)SSB
(D)DNA解鏈酶(E)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶
華東師范大學(xué)2007年第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
思考題10、打開DNA超螺旋的酶或蛋白質(zhì)是()
A、DNA解螺旋酶B、單連結(jié)合蛋白C、DNA旋轉(zhuǎn)酶D、DNA聚合酶1E、DNA聚合酶2
蘇州大學(xué)2006年11、DNA連接酶在下列那一過(guò)程中不需要?
A、DNA復(fù)制B、制備重組DNA
C、DNA修復(fù)D、DNA斷裂
廈門大學(xué)2011年第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-12、山東大學(xué)2015
名詞解釋:滾環(huán)復(fù)制
判斷:1).大腸桿菌DNA聚合酶I具5’-3’外切酶活性,也可以RNA為底物。2).基因組DNA復(fù)制,先導(dǎo)鏈引物為DNA,后隨鏈引物為RNA。3).因所有的DNA聚合酶都按5’-3’催化鏈延長(zhǎng),因此推測(cè)必定存在一種未發(fā)現(xiàn)的酶能按3’-5’催化復(fù)制叉上第二條鏈?zhǔn)怪娱L(zhǎng)。思考題第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
思考題13、大腸桿菌DNA復(fù)制和體外酶促擴(kuò)增DNA的比較。中國(guó)藥科大學(xué)20132.、為什么說(shuō)DNA復(fù)制以5’-3’為模板的是半不連續(xù)復(fù)制,它如何完成復(fù)制過(guò)程。2015考研827生化回憶版_天津大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-五
真核生物DNA復(fù)制P424
真核生物染色質(zhì)的基本單位:核小體,核小體DNA長(zhǎng)度200bp左右,真核生物岡崎片段較短的長(zhǎng)度200bp左右,相當(dāng)于一個(gè)核小體DNA長(zhǎng)度多起點(diǎn)復(fù)制,酵母復(fù)制起點(diǎn)ARS第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的差異(1).真核生物復(fù)制慢:原核細(xì)胞DNA復(fù)制叉移動(dòng)速度快,細(xì)菌復(fù)制叉移動(dòng)速度為50000bp/min,哺乳動(dòng)物DNA復(fù)制叉移動(dòng)速度慢,約為1000~3000bp/min。(2).真核細(xì)胞含多個(gè)復(fù)制子,多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。人平均每個(gè)染色體上有1000個(gè)復(fù)制子,原核細(xì)胞DNA中多數(shù)只有一個(gè)復(fù)制子。(3).
真核細(xì)胞的復(fù)制子在每個(gè)細(xì)胞周期僅復(fù)制一次,原核細(xì)胞在快速生長(zhǎng)時(shí),在DNA復(fù)制起點(diǎn)可連續(xù)復(fù)制多次,(4).
引物和岡崎片段較短
(5).
連接酶需ATP
(6).
端粒的復(fù)制(7).
聚合酶和蛋白質(zhì)因子不同。真核細(xì)胞DNA與組蛋白結(jié)合成核小體,原核細(xì)胞DNA不存在核小體。P425第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(1).Semi-conservativereplication(2).Semi-discontinuousrepliction(3).DNAhelicase(4).RNApriming(5).
校對(duì)(Proofreading)(6).
單鏈結(jié)合蛋白真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的相同點(diǎn)2.原核生物與真核生物復(fù)制的差異2015年?yáng)|北師范大學(xué)(851)生物化學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
真核生物的五種DNA聚合酶DNA-polⅢDNA-polⅠ類似原核生物DnaG,primase德爾塔伊普西龍?jiān)诤怂崦盖腥ヒ锖?,補(bǔ)引物缺口合成引物:RNA+DNA主要的復(fù)制酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
真核生物的五種DNA聚合酶(1)DNA-pol
(核內(nèi)):起始引發(fā),有引物酶活性。
(DNA-polα+primase形成緊密的復(fù)合物)(2)DNA-pol
(核內(nèi)):參與低保真度的復(fù)制。(3)DNA-pol
(德爾塔)(核內(nèi)):延長(zhǎng)子鏈的主要酶,有持續(xù)合成DNA鏈的活性又有校讀功能,和組織相容抗原
PCNA)相互作用。(4)DNA-pol
(伊普西龍)(核內(nèi)):修復(fù)損傷DNA
和填補(bǔ)引物空隙的功能。(5)DNA-pol
(線粒體內(nèi)):在線粒體DNA復(fù)制中起作用。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA復(fù)制的起始起始DNA德爾塔第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
真核生物DNA復(fù)制的過(guò)程1、DNAPol
形成引物(RNA+DNA)2、兩個(gè)DNAPol
(德爾塔)或一個(gè)DNAPol
與一個(gè)DNA-pol
(伊普西龍)在引物后延長(zhǎng)DNA3、RNaseH1和FEN1(MF-1)蛋白切除岡崎片段RNA引物的4.
DNA聚合酶ε填補(bǔ)缺口,類似細(xì)菌-DNA-polⅠ5.
DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng),需要ATP供能。DNA-pol
(德爾塔)(核內(nèi)):延長(zhǎng)子鏈的主要酶起作用。伊普西龍第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-真核生物引物的切除和補(bǔ)缺口FEN1又寫為MF-1
pol
(伊普西龍)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-真核和原核細(xì)胞的DNA復(fù)制比較
功能
E.coli
人復(fù)制酶PolⅢ的全酶Polδ進(jìn)行性因子
夾子PCNA定位因子復(fù)合體RF-CSSB引物酶DnaGPolα-引發(fā)酶去除引物的酶
DNA聚合酶1
RNaseH1和MF-1后隨連修復(fù)酶DNA聚合酶1和DNA聚合酶εDNA連接酶DNA連接酶1解旋酶DnaBT抗原消除拓?fù)鋸埩γ感D(zhuǎn)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶單鏈結(jié)合蛋白SSBRP-A起始蛋白DnaAT抗原
注:MF-1又寫為FEN1P426第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-環(huán)狀DNA
大腸桿菌能否完整復(fù)制真核生物鏈狀染色體?線狀DNA:滯后鏈復(fù)制不完整5端
DNA復(fù)制的末端第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-端粒和端粒酶端粒是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。端粒由成百個(gè)6個(gè)核苷酸的重復(fù)序列所組成(人TTAGGG,四膜蟲為TTGGGG),富含G。端粒也被科學(xué)家稱作“生命時(shí)鐘”。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-端粒和端粒酶
人類端粒酶含三部分:(端粒酶RNA)、(端粒酶協(xié)同蛋白)、(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶),除骨髓干細(xì)胞、胚胎原始干細(xì)胞等細(xì)胞外,大多數(shù)正常人體細(xì)胞失去端粒酶活性。惡性腫瘤細(xì)胞中,85%~90%端粒酶強(qiáng)陽(yáng)性。端粒酶可作為腫瘤標(biāo)志和腫瘤治療靶點(diǎn).原核生物沒(méi)有端粒酶端粒酶(telomerase):是一種反轉(zhuǎn)錄酶,修補(bǔ)端粒序列第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
由RNA(做模版)和蛋白質(zhì)(逆轉(zhuǎn)錄酶)構(gòu)成的一種核糖核蛋白復(fù)合體,維持端粒的長(zhǎng)度。端粒酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-端粒的形成第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-六、
DNA復(fù)制的忠實(shí)性機(jī)制(補(bǔ)充)
DNA復(fù)制的差錯(cuò)率只有10-8-10-101.
DNA聚合酶的選擇作用(根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)律,但堿基有烯醇式和酮式兩種構(gòu)象)(104-105)2.DNA聚合酶本身具有校正功能(3'→5'外切酶活性)(102-103)
加入錯(cuò)配堿基后合成速率下降,為校對(duì)修復(fù)留出時(shí)間:動(dòng)力學(xué)校對(duì)3.
細(xì)胞內(nèi)有錯(cuò)配修復(fù)等損傷修復(fù)系統(tǒng)4.
細(xì)胞維持dNTP的平衡水平;5.
RNA作為合成引物(起始合成時(shí)易出錯(cuò));前導(dǎo)鏈和滯后鏈的忠實(shí)性程度往往不同DNA復(fù)制時(shí),新鏈合成都遵循堿基配對(duì)原則!(102-103)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1.哪些機(jī)制保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性?為什么生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性沒(méi)有DNA復(fù)制準(zhǔn)確性高?
中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)2012年生物化學(xué)2、判斷:與原核生物不同,幾乎所有的真核細(xì)胞都發(fā)現(xiàn)有端聚酶。2013年中山大學(xué)3.端粒酶是:
A、限制性內(nèi)切酶
B、DNA聚合酶C、RNA聚合酶
D、肽?;D(zhuǎn)移酶
廈門大學(xué)2011年招思考題第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題南開大學(xué)20102011年中國(guó)海洋大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-6.判斷:所有的岡崎片段都是從5'---3'方向合成,在3'端延長(zhǎng)。
廈門大學(xué)2011年招7、下列與DNA解鏈無(wú)關(guān)的是?
A、單鏈DNA結(jié)合蛋白B、DNA解旋酶
C、DNA旋轉(zhuǎn)酶D、DNA酶
南師大2013思考題8、原核生物復(fù)制叉上有何活動(dòng)和需要什么酶華中科技大學(xué)生化2014第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-8、山東大學(xué)2015
簡(jiǎn)答:DNA復(fù)制方向5’-3’,若以3’dNTP為DNA復(fù)制原料,DNA復(fù)制方向可以是3’-5’。思考題5`活性5`端非活性3`端第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-5'3'復(fù)制方向的原因原因:(1).核苷酸均為5'核苷酸(2).錯(cuò)誤堿基采取水解去除的方式(3)錯(cuò)誤堿基去除后的主鏈可以直接進(jìn)行下一輪反應(yīng)PPPOH5'3'第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-PPPOH5'3'思PPPO5'3'PPPOH5'3'思5→3
聚合酶3→5外切酶123錯(cuò)誤后校對(duì)可以直接進(jìn)行下一輪反應(yīng)5'3'復(fù)制方向的原因第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-PPPOH5'3'POH5'3'5`→3`聚合酶POH5'3'3→5外切酶PPPOH5'3'如果進(jìn)行下一輪反應(yīng),5'需要重新活化123錯(cuò)誤后校對(duì)3'→5'復(fù)制方向?最初第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-第二節(jié)DNA的損傷和修復(fù)
DNA損傷(DNAdamage):是指DNA結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息的改變。DNA的自發(fā)性損傷堿基錯(cuò)配:堿基異構(gòu)、脫氨基和修飾物理因素引發(fā)的損傷紫外線電離輻射化學(xué)因素引發(fā)的損傷堿基烷基化、堿基脫落等堿基類似物P427第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
DNA的損傷修復(fù)修復(fù)形式
損傷特點(diǎn)
pol
修復(fù)特點(diǎn)直接修復(fù)
不打斷鏈,不切除錯(cuò)配修復(fù)修復(fù)復(fù)制錯(cuò)配堿基pol
Ⅲ切除可達(dá)1000nt堿基切除修復(fù)修復(fù)單個(gè)堿基損傷pol1先去除堿基,再切幾個(gè)nt核苷酸切除修復(fù)修復(fù)較大的損傷pol1如,切除13或29ntSOS反應(yīng)很大的損傷pol1
(Ⅳ/Ⅴ
)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-錯(cuò)配修復(fù)(修復(fù)復(fù)制中錯(cuò)配的錯(cuò)誤)
1、定義:在含有錯(cuò)配堿基對(duì)的分子中使正常的核苷酸序列恢復(fù)的修復(fù)方式。
2、參與錯(cuò)配修復(fù)的酶與蛋白質(zhì):
Dam甲基化酶;
MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ;RecJ核酸酶;
SSB;DNA聚合酶Ⅲ;DNA連接酶;
(一)DNA錯(cuò)配修復(fù)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DnaBDnaGDnaCHU
DNA錯(cuò)配修復(fù)AC識(shí)別新生鏈中非m6A
的GATC序列DNA聚合酶Ⅲ;DNA連接酶;第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
大腸桿菌的錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-大腸桿菌的錯(cuò)配修復(fù)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-
新合成的子代鏈未甲基化
幾分鐘后,新合成的子代鏈甲基化
大腸桿菌的復(fù)制起始的調(diào)控?第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-思考題2010年南開大學(xué)第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-(二)
DNA的直接修復(fù)
DNA直接修復(fù):修復(fù)過(guò)程不要切除堿基或核苷酸1、光復(fù)活:可見光(最有效波長(zhǎng)400nm)激活生物界廣泛分布(高等哺乳動(dòng)物,如人類,除外)的光復(fù)活酶,該酶分解嘧啶二聚體.是一種高度專一的修復(fù)形式,只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚體.2
O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶:將DNA上的被修飾的甲基(鳥嘌呤O6位上的甲基)移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上。此時(shí),轉(zhuǎn)甲基酶自身被甲基化而失活,防止G-T對(duì)形成。第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1、光復(fù)活
為什么細(xì)菌在紫外光照射后在可見光下比暗處更容易存活?川大生物化學(xué)2015年紫外線可以形成的胸腺嘧啶二聚體可見光可激活光復(fù)活酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-光復(fù)活酶的存在
光復(fù)活酶從單細(xì)胞生物到鳥類均有,高等哺乳動(dòng)物沒(méi)有此酶,而采用切除修復(fù)UV照射而形成的嘧啶二聚體。
為什么細(xì)菌在紫外光照射后在可見光下比暗處更容易存活?第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-2
O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶
Removesthemethylgroup.Themethylgroupistransferredtotheproteinitself,inactivatingtheprotein.第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-1、概念:在一系列酶的作用下,將DNA分子中受損傷部分切除,并以完整的那一條鏈為模板,合成出切去部分,DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)缺陷的修復(fù):(1)核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA損傷部位,在其附近將其切開。(2)核酸外切酶切除損傷的DNA。(3)DNA聚合酶1修復(fù)。(4)DNA連接酶連接。2、類型:(三)、切除修復(fù)(核苷酸)切除修復(fù)(堿基)切除修復(fù)
單個(gè)堿基缺陷的修復(fù),如被堿基修飾,如烷基化結(jié)構(gòu)較大變形第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-堿基切除修復(fù)AP位點(diǎn)(無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)):DNA糖基化酶(糖苷鍵)可以切斷這種堿基N-糖苷鍵,將堿基除去,形成的脫堿基部位通常稱為"abasic"部位或AP位點(diǎn)。引發(fā)原因:DNA中U的出現(xiàn),堿基的修飾,自發(fā)脫堿基等β-糖苷鍵AP位點(diǎn)的形成第34章-DNA的復(fù)制和修復(fù)-2015-5-11-DNA中可能出現(xiàn)U胸腺嘧啶核苷酸
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