重組技術(shù)的應(yīng)用

重組技術(shù)的應(yīng)用二、基因診斷的原理及特點(diǎn)（一）基因診斷的原理第2頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）基因診斷的特點(diǎn)與傳統(tǒng)的診斷方法比較，基因診斷有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）以探測(cè)基因?yàn)槟繕?biāo)，屬于“病因診斷”，針對(duì)性強(qiáng)、特異性高；（2）由于檢測(cè)技術(shù)十分敏感，故診斷靈敏度相當(dāng)高；（3）由于基因探針或引物可為任何來(lái)源，任何種類，所以適應(yīng)性強(qiáng)，診斷范圍廣；（4）在感染性疾病的基因診斷中，不僅可檢出正在生長(zhǎng)的病原體，也能檢出潛伏的病原體；既能確定既往感染，也能確定現(xiàn)行感染；既能診斷普通菌株或病毒，也能檢出變異株；同時(shí)，能對(duì)那些不容易體外培養(yǎng)（如產(chǎn)毒性大腸桿菌）和不能在實(shí)驗(yàn)室安全培養(yǎng)（如立克次體）的病原體作出診斷，所以大大擴(kuò)大了診斷范圍。

第3頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、基因診斷的方法三十多年來(lái)，DNA診斷技術(shù)取得了飛速的發(fā)展，建立了以核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和序列分析為基礎(chǔ)的多種多樣的檢測(cè)方法，這些檢測(cè)方法可以用于遺傳疾病、腫瘤、傳染性疾病等的診斷。1. 基因診斷的常用方法常用檢測(cè)致病基因結(jié)構(gòu)異常的方法有下列幾種：第4頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑴

斑點(diǎn)雜交：DNA樣品的溶液被點(diǎn)在濾膜上，變性、中和、干燥固定等。標(biāo)記的探針直接和濾膜上的核酸雜交，再用放射自顯影或其他方法檢測(cè)雜交結(jié)果。

第5頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑵

等位基因特異的寡核苷酸探針（Allele-specificOligonucleotideProbe，ASOProbe）雜交：根據(jù)點(diǎn)突變位點(diǎn)上下游核苷酸序列，合成約15-20個(gè)左右的寡核苷酸片段，其中包含發(fā)生突變的堿基，經(jīng)放射性核素或地高辛標(biāo)記后作為探針，在嚴(yán)格雜交條件下，只有該點(diǎn)突變的DNA樣本，才出現(xiàn)雜交點(diǎn)，即使只有一個(gè)堿基不配對(duì)，也不可能形成雜交點(diǎn)。

第6頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑶

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）：是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別的點(diǎn)突變檢測(cè)方法。第7頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑷限制性內(nèi)切酶圖譜（restrictionmap）：如果DNA突變后改變了某一核酸限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，使原來(lái)某一識(shí)別位點(diǎn)消失，或形成了新的識(shí)別位點(diǎn)，那么相應(yīng)限制性內(nèi)切酶片段的長(zhǎng)度和數(shù)目會(huì)發(fā)生改變。

第8頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑸

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）：遺傳連鎖分析生物個(gè)體間DNA的序列存在差異，據(jù)估計(jì)每100-200個(gè)核苷酸中便有1個(gè)發(fā)生突變，這種現(xiàn)象稱為DNA多態(tài)性。

第9頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（6）基因芯片法（microarray）：又稱為DNA微探針陣列。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過(guò)與被標(biāo)記的若干靶核酸序列互補(bǔ)匹配，與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。

第10頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（7）DNA序列分析對(duì)致病有關(guān)的DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定，是診斷基因異常（已知和未知）最直接和準(zhǔn)確的方法。

第11頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.RNA診斷

RNA診斷是以mRNA為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)對(duì)待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析，確定其剪接、加工的缺陷及外顯子的變異，以判斷基因轉(zhuǎn)錄效率的高低，以及轉(zhuǎn)錄物的大小及正常與否，從而對(duì)疾病做出診斷。

（1）RNA印跡（northernblotting）RNA印跡是檢測(cè)基因是否表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物mRNA的大小的可靠方法，根據(jù)雜交條帶的強(qiáng)度，可以判斷基因表達(dá)的效率。

第12頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）RT-PCR是一種檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物mRNA靈敏的方法，若與熒光定量PCR結(jié)合可對(duì)RT-PCR產(chǎn)物量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。（3）mRNA差異顯示PCR技術(shù)（DDRT-PCR）：是在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)差異的有效方法。該技術(shù)在分析基因表達(dá)差異、繪制遺傳圖譜、分離特異性表達(dá)基因和臨床診斷遺傳疾病等方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)，因此一經(jīng)建立就被廣泛應(yīng)用,并取得了可喜的成果。

第13頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、基因診斷的應(yīng)用（一）感染性疾病感染性疾病的基因診斷方法與傳統(tǒng)的診斷方法相比，具有高度的敏感性和特異性，且簡(jiǎn)便、快捷。目前，商品化的診斷試劑盒，已經(jīng)在病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體及寄生蟲感染診斷中得到了廣泛應(yīng)用。應(yīng)用實(shí)時(shí)在線檢測(cè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)變化進(jìn)行病原體DNA的定量，結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，產(chǎn)物檢測(cè)始終在密閉狀態(tài)下進(jìn)行，有效地解決了產(chǎn)物污染這一難題?；蛟\斷還可檢出病毒變異或因機(jī)體免疫狀態(tài)異常等原因不能測(cè)出相應(yīng)抗原和抗體的病毒感染。第14頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天1病原體診斷

（1）病毒性感染多種病毒性感染都可采用基因診斷檢測(cè)相應(yīng)的病原體，基因診斷則可直接檢測(cè)病毒本身，具有高度敏感，快速準(zhǔn)確等獨(dú)特的優(yōu)越性。（2）細(xì)菌性感染可應(yīng)用基因診斷檢測(cè)多種致病性的細(xì)菌，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷依賴痰涂片鏡檢和結(jié)核桿菌的培養(yǎng)與鑒定，但陽(yáng)性率不高，所需時(shí)間長(zhǎng)。目前應(yīng)用PCR技術(shù)建立診斷方法，敏感度可達(dá)到少至100個(gè)細(xì)菌的水平，通過(guò)拷貝存在的特異性重復(fù)序列引物，既使菌株發(fā)生變異，也能準(zhǔn)確檢出。第15頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天2治療過(guò)程中的檢測(cè)（1）療效監(jiān)測(cè)：以PCR和基因芯片為主的核酸分析技術(shù)能對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測(cè)和變異分析，是療效觀察最好的檢測(cè)手段。（2）藥物基因組學(xué)：每個(gè)人由于遺傳背景的不同，對(duì)藥物的利用、代謝及敏感性均有差異，采用基因芯片檢測(cè)病人的相關(guān)基因信息，對(duì)臨床用藥提供最佳依據(jù)。總之，基因診斷技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用已越來(lái)越被人們所認(rèn)識(shí)，它在進(jìn)行傳染病疫情監(jiān)測(cè)病原體診斷、治療藥物選擇和療效檢測(cè)等方面具有十分重要的作用，必將為傳染病的防控和診治做出重大貢獻(xiàn)。第16頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）遺傳疾病基因診斷本身是在分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，在遺傳病的診斷方面成績(jī)最為突出，也最有發(fā)展前途，對(duì)許多已明確致病基因及其突變類型的遺傳病診斷效果良好。依據(jù)造成遺傳性疾病的原因又可以將其區(qū)分成：?jiǎn)我换蛉毕莸倪z傳疾病、染色體變異所引起的遺傳疾病及由多重基因共同影響所造成的遺傳疾病及線粒體基因的變異所引起的疾病。第17頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）惡性腫瘤從根本上說(shuō)，癌癥是細(xì)胞水平上的一種遺傳性紊亂，是一種基因性疾病。從正常細(xì)胞發(fā)展成癌細(xì)胞，一個(gè)基本的變化是細(xì)胞的生長(zhǎng)失去控制。相對(duì)于感染性疾病及單基因遺傳病來(lái)說(shuō)，腫瘤的基因診斷難度更大得多。但腫瘤的發(fā)生和發(fā)展從根本上離不開基因的變化，所以基因診斷在腫瘤疾病中也會(huì)有廣闊的前景。其重要表現(xiàn)有以下幾方面：（1）腫瘤的早期診斷及鑒別診斷；（2）腫瘤的分級(jí)、分期及預(yù)后的判斷；（3）微小病灶、轉(zhuǎn)移灶及血中殘留癌細(xì)胞的識(shí)別檢測(cè)；（4）腫瘤治療效果的評(píng)價(jià)。第18頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、問(wèn)題及展望隨著后基因組學(xué)的不斷深入和分子診斷技術(shù)的不斷更新，尤其是臨床醫(yī)學(xué)各學(xué)科與分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和儀器分析學(xué)等其他學(xué)科不斷交叉和互相滲透，人們對(duì)生物大分子和疾病關(guān)系的理解也會(huì)越來(lái)越深入，分子診斷將在對(duì)疾病的診斷、預(yù)防和治療方面發(fā)揮日益重要的作用，極大地推動(dòng)現(xiàn)代臨床診斷醫(yī)學(xué)的發(fā)展。第19頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、 基因治療的概念及內(nèi)容（一）基因治療的定義：是用正?；蛉〈∪思?xì)胞中的缺陷基因，以達(dá)到治療分子病的目的。根據(jù)病變基因所處的細(xì)胞類型，基因治療可分為兩種形式，一種是改變體細(xì)胞的基因表達(dá)，即體細(xì)胞基因治療（somaticgenetherapy）；另一種是改變生殖細(xì)胞的基因表達(dá)，即種系基因治療（germlinegenetherapy）。第二節(jié)疾病的基因治療第20頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）基因治療的基本內(nèi)容基因治療包括基因診斷、基因分離、載體構(gòu)建以及基因轉(zhuǎn)移四項(xiàng)基本內(nèi)容。

基因分離是指利用DNA重組技術(shù)克隆、鑒定、擴(kuò)增、純化用于治療的基因，并根據(jù)病變基因的定位，與特異性整合序列(即同源序列)和基因表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行體外重組操作。載體構(gòu)建指將上述治療用的基因安裝在合適的載體上?；蜣D(zhuǎn)移有兩種方式，一種是體外導(dǎo)入（exvivo）,即在體外將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，再將這種基因修飾過(guò)的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)，使這種帶有外源基因的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到治療或預(yù)防的目的。另一種是體內(nèi)導(dǎo)入（invivo），即將外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。第21頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、基因治療的分子機(jī)制用于基因治療的基因根據(jù)其功能及作用可分為以下四類。（1）基因矯正（genecorrection）和基因置換（genereplacement），即將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正，對(duì)缺陷基因精確地原位修復(fù)，不涉及基因組的其他任何改變。（2）基因增強(qiáng)（geneaugmentation），不去除異?；颍ㄟ^(guò)導(dǎo)入外源基因使其表達(dá)正常產(chǎn)物，從而補(bǔ)償缺陷基因等的功能；（3）基因失活（geneinactivation），有些基因異常過(guò)度表達(dá)，如癌基因或病毒基因可導(dǎo)致疾病，可用反義核酸技術(shù)、核酶或誘餌（decoy）轉(zhuǎn)錄因子來(lái)封閉或消除這些有害基因的表達(dá)。（4）自殺基因（suicidegene），有些酶在動(dòng)物體內(nèi)是不存在的。如果將它們轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，再輔以原代謝物或藥物，就能殺滅癌細(xì)胞。因此這類酶稱為自殺酶，相應(yīng)的基因則為自殺基因。

第22頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、載體系統(tǒng)基因?qū)胼d體系統(tǒng)是基因治療的關(guān)鍵技術(shù)，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。

四、基因治療的策略與方法1.基因治療的靶組織肌肉、心肌、血管、肝、腦、皮膚、呼吸道、黏膜、腫瘤等組織均可作為基因治療的靶組織。2.基因治療的策略分子生物學(xué)的飛速發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的完成，使人們能夠正確了解人類基因組的結(jié)構(gòu)和功能，認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生的分子機(jī)制，這將為開展疾病的基因治療奠定基礎(chǔ)?；蛑委煹幕静呗杂幸韵聨追N。第23頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）基因置換

基因置換就是把正常的外源基因?qū)肷矬w靶細(xì)胞內(nèi)，對(duì)致病基因進(jìn)行原位重組置換，以恢復(fù)基因的原有正常功能，從而達(dá)到治療的目的。（2）基因矯正

基因矯正是指原位修復(fù)致病基因的點(diǎn)突變，以恢復(fù)原有基因的功能，而不一定改變致病基因的結(jié)構(gòu)。（3）基因修飾

基因修飾就是將有功能的目的基因?qū)朐l(fā)病灶的細(xì)胞或其他類型的相關(guān)細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)償致病基因的功能，但致病基因本身未得到改變。（4）基因抑制

基因抑制是指導(dǎo)入外源基因以抑制原有的基因，其目的在于阻斷有害基因的表達(dá)。（5）基因封閉

利用反義RNA堿基互補(bǔ)原理，通過(guò)載體的介導(dǎo)性封閉或阻斷有害基因的表達(dá)，從而達(dá)到基因治療的目的。第24頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.基因治療中基因轉(zhuǎn)移方法（1）基因轉(zhuǎn)移的物理方法

基因轉(zhuǎn)移的物理方法包括：直接注射、電脈沖介導(dǎo)法和顯微注射微粒子轟擊法等。（2）基因轉(zhuǎn)移的化學(xué)方法

基因轉(zhuǎn)移的化學(xué)方法包括DNA磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色體介導(dǎo)法、脂質(zhì)體包埋、多聚季鐵鹽等化學(xué)試劑轉(zhuǎn)移方法。（3）基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)方法

基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)方法主要是指病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，包括RNA病毒和DNA病毒兩類，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純疤疹病毒、痘苗病毒等。第25頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、疾病的基因治療（一）遺傳性單基因疾病的基因治療是基因治療的理想侯選對(duì)象，設(shè)計(jì)治療方案時(shí)應(yīng)考慮下列幾點(diǎn)因素：⑴對(duì)造成該疾病有關(guān)的基因應(yīng)有較詳細(xì)的了解，并能在實(shí)驗(yàn)室克隆適合真核細(xì)胞表達(dá)的有關(guān)基因的cDNA序列，供轉(zhuǎn)導(dǎo)用；⑵經(jīng)有功能基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的體細(xì)胞，只要產(chǎn)生較少量原來(lái)缺少的基因產(chǎn)物就能矯正疾?。虎羌词箤?dǎo)入基因過(guò)度表達(dá)，對(duì)機(jī)體應(yīng)無(wú)不良作用；⑷有些遺傳疾病是某些特殊細(xì)胞基因缺損造成的，但那有關(guān)的細(xì)胞不易取出供體外基因工程操作用；⑸現(xiàn)在采用的以正常有功能的同源基因來(lái)增補(bǔ)體內(nèi)的缺乏基因，因此要求增補(bǔ)的基因在病人壽命期間能穩(wěn)定表達(dá)，或重復(fù)治療，所以應(yīng)考慮構(gòu)建能長(zhǎng)期持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)外源基因的載體，并考慮將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞。第26頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天第27頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）病毒性感染

目前病毒性感染主要治療對(duì)象為人免疫缺陷病毒（HIV）感染的艾滋病，主要有二種治療策略：①增強(qiáng)機(jī)體的抗HIV免疫反應(yīng)；②抑制HIV的復(fù)制。許多科學(xué)家尚在研究其他更有效的抑制HIV復(fù)制的方法。第28頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）

惡性腫瘤惡性腫瘤屬?gòu)?fù)雜基因疾病(complexgeneticdiseases)，可能涉及多種基因的異常，發(fā)病過(guò)程是多步驟的，至今雖有不少有關(guān)的基因被鑒定，但腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未清楚，目前臨床惡性腫瘤的基因治療策略有十余種之多。主要的有：1.免疫基因治療(immunogenetheray)2.自殺基因系統(tǒng)3.抑癌基因(tumorsuppressivegene)4.裂解腫瘤病毒（oncolyticvirus）第29頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）心血管疾病目前心血管疾病中基因治療最多的臨床方案為外周血管疾病造成的下肢缺血，及心臟冠狀動(dòng)脈阻塞造成的心肌缺血。通過(guò)轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）或血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等基因于血管病疫部位，通過(guò)這些因子的表達(dá)，以促進(jìn)新生血管的生成，從而建立側(cè)肢循環(huán)，改善血供。

第30頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、問(wèn)題及展望基因療法作為一種新興的治療技術(shù)無(wú)疑是近30年來(lái)生命科學(xué)發(fā)展的一種結(jié)果。時(shí)代在發(fā)展，科技在進(jìn)步，理論在創(chuàng)新，高科技研究成果的出現(xiàn)如同任何新生事物的誕生一樣，運(yùn)用合理，將有無(wú)限的生機(jī)與活力；應(yīng)用不當(dāng)，也會(huì)給人類造成極大的隱患。隨著分子技術(shù)的飛速發(fā)展，期望基因治療會(huì)有一個(gè)美好的前景，實(shí)現(xiàn)真正的臨床突破，造福人類指日可待。第31頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天

由病毒、衣原體、支原體、立克次體、細(xì)菌、真菌、螺旋體、原蟲、蠕蟲等引起的疾病稱為感染性疾?。╥nfectiousdiseases）。感染性疾病中具傳染性并可導(dǎo)致不同程度流行則又稱傳染病（communicablediseases，contagiousdiseases）。第三節(jié)傳染病的防治第32頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、新發(fā)和再發(fā)傳染病的特征傳染病的致病因素是有生命的病原體，它在人體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程與其他致病因素所造成的疾病有本質(zhì)上的區(qū)別，主要表現(xiàn)在：①有病原體：每一個(gè)傳染病都是由特異性的病原體所引起的；②有傳染性：這是傳染病與其他感染性疾病的主要區(qū)別。③有流行病學(xué)特征：傳染病的流行過(guò)程在自然和社會(huì)因素的影響下，表現(xiàn)出各種特征。④有感染后免疫：動(dòng)物、人體感染病原體后，無(wú)論是顯性或隱性感染，都能產(chǎn)生針對(duì)病原體及其產(chǎn)物(如毒素)的特異性免疫；⑤大多數(shù)傳染病都具有該種病特征性的綜合癥狀和一定的潛伏期和病程經(jīng)過(guò)。第33頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、傳染病防治的新策略及研究?jī)?nèi)容1.研究流行性傳染病的快速診斷技術(shù)基因型是遺傳特征，相當(dāng)穩(wěn)定可靠，可以作為病原體鑒定和診斷的重要依據(jù)。通過(guò)從基因水平上進(jìn)行檢測(cè)，可進(jìn)行早期診斷，并可直接探知病原體在體內(nèi)的消長(zhǎng)過(guò)程及其與機(jī)體相互作用而致機(jī)體損害的細(xì)節(jié)，從而在疾病表現(xiàn)型出現(xiàn)之前或早期采取相應(yīng)的防治措施。2.疫苗的研究防治傳染病最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法是對(duì)易感人群進(jìn)行預(yù)防接種。利用DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)的各類工程疫苗有望成為防治傳染病的重要手段。第34頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.預(yù)防和控制藥物的篩選科學(xué)家們正在積極制作基因藥物，希望能盡快篩選出對(duì)新病毒有預(yù)防和控制療效的藥物。4.分子流行病學(xué)規(guī)律研究從基因、基因組（蛋白、蛋白組，包括基因組和蛋白組的變異）、細(xì)胞和機(jī)體等不同層次，研究病毒與宿主的相互作用關(guān)系、致病機(jī)理、感染的分子過(guò)程等，揭示病毒源、病毒感染途徑、病毒性疾病的發(fā)生與流行規(guī)律等，為病源控制、診斷技術(shù)、疫苗研制、藥物篩選與研制、病毒性疾病流行預(yù)警等提供科學(xué)依據(jù)。5.遺傳進(jìn)化關(guān)系研究追本溯源，查明病原來(lái)源，確定病原與人、與動(dòng)物的關(guān)系，以有效控制疫病。第35頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、基因工程疫苗所謂基因工程疫苗就是用基因工程方法或分子克隆技術(shù)，分離出病原的保護(hù)性抗原基因，將其轉(zhuǎn)入原核或真核系統(tǒng)使表達(dá)出該病原的保護(hù)性抗原，制成疫苗，或者將病原的毒力相關(guān)基因刪除掉，使成為不帶毒力相關(guān)基因的基因缺失苗。第36頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）基因工程亞單位疫苗上世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)從病原分離得到的結(jié)構(gòu)組成具有免疫原性，這種非傳染性的亞單位能激發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng)，而不具有由完整病原免疫可能帶來(lái)的副作用。（二）顆粒載體疫苗一些基因的表達(dá)產(chǎn)物可以裝配成多聚體顆粒，將病原中編碼保護(hù)性抗原決定簇的基因片段融合到這些載體基因中，能表達(dá)并裝配成雜合顆粒，而病原的決定簇可能暴露于顆粒表面，賦與多個(gè)決定簇和顆粒性等優(yōu)點(diǎn)，其免疫原性大大優(yōu)于單價(jià)可溶性多肽疫苗。第37頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）病毒活載體疫苗其原理是將外源目的基因插入載體病毒基因組的某些部位，使之高效表達(dá)但不影響該疫苗株的生存與繁殖。（四）細(xì)菌活載體疫苗細(xì)菌活載體疫苗，除具有病毒活載體的優(yōu)點(diǎn)外，它還具有培養(yǎng)方便、外源基因的容納量大、刺激細(xì)胞免疫力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此具有巨大的潛力。第38頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（五）基因缺失疫苗基因缺失疫苗是通過(guò)基因工程方法，將與強(qiáng)毒株的毒力有關(guān)基因刪除，既不影響其增殖或復(fù)制，又保持其免疫原性的活疫苗。其突出的優(yōu)點(diǎn)是疫苗株穩(wěn)定，不易返強(qiáng)，十分安全。由于其免疫機(jī)制與感染相似，免疫針對(duì)多種抗原決定簇。

（六）DNA重組疫苗它是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。第39頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、基因工程抗體基因工程抗體是利用抗體工程技術(shù)在基因水平上對(duì)抗體分了進(jìn)行重組和改造，并導(dǎo)入原核、真核、酵母或重組病毒等表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)、生產(chǎn)的抗體。真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后修飾功能，能指導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的折疊、裝配和翻譯后修飾，使抗體分子更接近于人源蛋白，與原核表達(dá)系統(tǒng)有很大的差別。目前基因工程抗體的研發(fā)主要包括兩部分：一是對(duì)已有的單克隆抗體進(jìn)行改造，包括單克隆抗體的人源化(嵌合抗體、人源化抗體)、小分子抗體(Fab,ScFv,dsFv,diabody,minibody等)以及抗體融合蛋白的制備；二是通過(guò)抗體庫(kù)的構(gòu)建,使得抗體不需抗原免疫即可篩選并克隆新的單克隆抗體。第40頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、DNA重組技術(shù)在傳染病防治前景展望

20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的基因工程為代表的生物技術(shù)為人與動(dòng)物傳染病預(yù)防與控制提供了新的手段，它大大沖擊和豐富了這一領(lǐng)域的研究，使新方法、新技術(shù)、新藥物和新構(gòu)思層出不盡。各種工程疫苗和抗體的產(chǎn)生為傳染病的防治掀開新的篇章，盡管目前在某些方面還不成熟，但人們相信隨著對(duì)生命本質(zhì)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，DNA重組技術(shù)和分子免疫學(xué)的發(fā)展，人們隨意制造疫苗和抗體消滅傳染病的時(shí)代即將到來(lái)。第41頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)工程的概念與研究?jī)?nèi)容（一）蛋白質(zhì)工程的概念從廣義上講，蛋白質(zhì)工程是指通過(guò)蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動(dòng)力學(xué)的研究獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)和生物等方面的信息，在此基礎(chǔ)上對(duì)編碼該蛋白的基因通過(guò)基因重組等技術(shù)進(jìn)行有目的的設(shè)計(jì)改造，并將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終將其投入實(shí)際應(yīng)用的工程。第四節(jié)蛋白質(zhì)工程第42頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）蛋白質(zhì)工程研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)工程是以改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)和制造新型蛋白質(zhì)為中心的，其主要研究?jī)?nèi)容是：根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或依據(jù)氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，進(jìn)而設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新的蛋白質(zhì)。利用蛋白質(zhì)工程改造蛋白質(zhì)的一般步驟是：①分離純化需改造的目的蛋白；②對(duì)目的蛋白分析，獲取盡可能多的有關(guān)目的蛋白的信息；③設(shè)計(jì)核酸引物或探針，從cDNA文庫(kù)或核基因文庫(kù)中獲取編碼該蛋白的基因序列；④從預(yù)期的結(jié)構(gòu)和功能出發(fā)，設(shè)計(jì)對(duì)目的蛋白進(jìn)行改造的方案；⑤對(duì)基因序列進(jìn)行插入、刪除、置換和改組等改造；⑥將經(jīng)過(guò)改造的基因片段插入適當(dāng)?shù)妮d體，并在合適的宿主中表達(dá)；⑦分離純化表達(dá)產(chǎn)物，檢測(cè)其是否達(dá)到了預(yù)期目的。第43頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)工程分子設(shè)計(jì)的理性策略蛋白質(zhì)工程的實(shí)踐依據(jù)是DNA指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。從突變基因入手定向改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)主要有兩大設(shè)計(jì)理念：建立在對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系深入理解基礎(chǔ)上的分子理性設(shè)計(jì)，以及建立在體外模擬自然進(jìn)化過(guò)程基礎(chǔ)上的非理性設(shè)計(jì)范疇的分子定向進(jìn)化(MolecularDirectedEvolution)。第44頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、蛋白質(zhì)定向改造的方法主要是通過(guò)克隆基因的DNA序列進(jìn)行操作來(lái)生產(chǎn)具有新特性的蛋白質(zhì)。第45頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用1提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

2融合蛋白質(zhì)

3蛋白質(zhì)活性的改變

4治癌酶的改造5嵌合抗體和人緣化抗體第46頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、蛋白質(zhì)工程前景與展望當(dāng)前，蛋白質(zhì)工程是發(fā)展較好、較快的生物學(xué)技術(shù)。匯集了當(dāng)代分子生物學(xué)等學(xué)科的一些前沿領(lǐng)域的最新成就，它把核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物功能結(jié)合起來(lái)研究。蛋白質(zhì)工程將蛋白質(zhì)與酶的研究推進(jìn)到嶄新的時(shí)代，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用開拓了誘人的前景。蛋白質(zhì)工程開創(chuàng)了按照人類意愿改造、創(chuàng)造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時(shí)期。第47頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、途徑工程的基本概念利用DNA重組技術(shù)對(duì)生物細(xì)胞內(nèi)固有代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行改造設(shè)計(jì)的嘗試就屬于第三代基因工程，即途徑工程（PathwayEngineering）。二、途徑工程的