HJ 755-2015 水質(zhì) 總大腸菌群和糞大腸菌群的測(cè)定 紙片快速法（正式版）

中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的測(cè)定紙片快速法 2015-10-22發(fā)布 2術(shù)語(yǔ)和定義 4試劑和材料 26樣品 27分析步驟 3 9精密度和準(zhǔn)確度 510質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 6 6附錄A(資料性附錄)結(jié)果判定參考圖片 7附錄B(資料性附錄)最大可能數(shù)(MPN)表 8為貫徹《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國(guó)水污染防治法》,保護(hù)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中總大腸菌群和糞大腸菌群的測(cè)定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了地表水和廢水中總大腸菌群和糞大腸菌群測(cè)定的紙片快速法。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)附錄A和附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由環(huán)境保護(hù)部科技標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：常州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、環(huán)境保護(hù)部環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證單位：上海市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、浙江省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、蘇州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站、南京市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站和泰州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站。本標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境保護(hù)部2015年10月22日批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)自2015年12月1日起實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由環(huán)境保護(hù)部解釋。1水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的測(cè)定紙片快速法1適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中總大腸菌群和糞大腸菌群的紙片快速法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、廢水中總大腸菌群和糞大腸菌群的快速測(cè)定。本方法的檢出限為20MPN/L。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。37℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。44.5℃培養(yǎng)，24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。最大可能數(shù)mostprobablenum微生物檢驗(yàn)常用發(fā)酵法，又稱稀釋法，是一種利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理定量檢測(cè)微生物濃度的方法。它根據(jù)不同稀釋度一定體積樣品中被檢微生物存在與否的頻率，查表求得樣品中微生物的濃度，與直接報(bào)告菌落數(shù)的平板計(jì)數(shù)法不同，它最終報(bào)告的是樣品中最有可能存在的目標(biāo)微生物濃度，這個(gè)以最大可能存在的濃度，就被稱為最大可能數(shù)(mostprobablenumber,MPN)。3方法原理按MPN法，將一定量的水樣以無(wú)菌操作的方式接種到吸附有適量指示劑(溴甲酚紫和2,3,5-氯化三苯基四氮唑即TTC)以及乳糖等營(yíng)養(yǎng)成分的無(wú)菌濾紙上，在特定的溫度(37℃或44.5℃)培養(yǎng)24h,當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖時(shí)，產(chǎn)酸使pH值降低，溴甲酚紫指示劑由紫色變黃色，同時(shí)，產(chǎn)氣過程相應(yīng)的脫氫酶在適宜的pH范圍內(nèi)，催化底物脫氫還原TTC形成紅色的不溶性三苯甲胰(TTF),即可在產(chǎn)酸后的黃色背景下顯示出紅色斑點(diǎn)(或紅暈)。通過上述指示劑的顏色變化就可對(duì)是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作出判斷，從而確定是否有總大腸菌群或糞大腸菌群存在，再通過查MPN表就可得出相應(yīng)總大腸菌群或糞大腸菌群的4試劑和材料除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑。4.1市售水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群測(cè)試紙片：10ml水樣量紙片、1ml水樣量紙片按以下方法進(jìn)行質(zhì)量鑒定，達(dá)到要求后方可使用。2(1)外層鋁箔包裝袋應(yīng)密封完好，內(nèi)包裝聚丙烯塑膜袋無(wú)破損。(2)紙片外觀應(yīng)整潔無(wú)毛邊，無(wú)損壞，呈均勻淡黃綠色，加去離子水或蒸餾水后呈紫色，無(wú)論加水與否，應(yīng)無(wú)雜色斑點(diǎn)，無(wú)明顯變形，表面平整。紙片不加水紙片加水(3)紙片加入相應(yīng)水樣，充分浸潤(rùn)、吸收后，將內(nèi)包裝聚丙烯塑膜袋倒置，袋口應(yīng)無(wú)水滴懸掛。(4)紙片以去離子水或蒸餾水充分潤(rùn)濕后，其pH值應(yīng)在7.0～7.4范圍內(nèi)。(5)紙片和內(nèi)包裝聚丙烯塑膜袋應(yīng)無(wú)菌，加入相應(yīng)水量的無(wú)菌水，37℃±1℃培養(yǎng)24h后，紙片應(yīng)無(wú)微生物生長(zhǎng)，其紫色保持不變，且無(wú)紅斑出現(xiàn)。(6)按7.4.2中的方法進(jìn)行總大腸菌群和糞大腸菌群陰性、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株檢驗(yàn)，其特性應(yīng)符合要求。用新制備的去離子水或蒸餾水，按無(wú)菌操作要求，121℃高壓蒸汽滅菌20min,備用。4.3硫代硫酸鈉溶液：p(Na?S?O?)=0.10g/ml。稱取硫代硫酸鈉10g,溶于適量蒸餾水(或去離子水)中，稀釋至100ml,現(xiàn)配。4.4乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液：p(C??H??N?O?Na?-2H?O)=0.15g/ml。稱取EDTA-Na?15g,溶于適量蒸餾水(或去離子水)中，稀釋至100ml,此溶液保質(zhì)期為30d。5儀器和設(shè)備5.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。5.2恒溫培養(yǎng)箱：44.5℃±0.5℃。5.3高壓蒸汽滅菌器：121℃、101.3kPa。5.4冰箱：0～4℃。5.5移液管：1ml±0.01ml、10ml±0.1ml。5.7采樣瓶：250ml。6.1樣品采集與其他項(xiàng)目一同采樣時(shí)，先單獨(dú)采集微生物樣品，采樣瓶不得用水樣洗滌，按無(wú)菌操作的要求采集水樣約200ml于滅菌的采樣瓶中。3采集江、河、湖、庫(kù)等地表水樣時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，距水面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔玻塞，使水樣灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平前推。采好水樣后，迅速扎上無(wú)菌包裝紙。從龍頭裝置采集樣品時(shí)，不要選用漏水的龍頭，采水前將龍頭打開至最大，放水3～5min;然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌，開足龍頭，再放水1min,以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jī)?nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的水樣時(shí)，可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。6.2樣品保存采樣后2h內(nèi)檢測(cè)，否則，需10℃以下冷藏并不得超過6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開展檢測(cè)的，應(yīng)將樣品放入0～4℃冰箱并2h內(nèi)測(cè)定。6.3干擾和消除如果采集的是含有余氯或經(jīng)過加氯處理的水樣，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(4.3)0.2ml;如果采集的是重金屬離子含量較高的水樣，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(4.4)0.6ml,以消除干擾。加入干擾消除劑的采樣瓶121℃高壓蒸汽滅菌20min,采樣瓶外壁及包扎紙干燥后可用于樣品采集。酸性樣品，需在分析前按無(wú)菌操作要求調(diào)節(jié)樣品的pH值至7.0～8.0。7分析步驟以下步驟均在無(wú)菌操作的條件下進(jìn)行。7.1接種水樣的準(zhǔn)備當(dāng)每張紙片接種水樣量為10ml或1ml時(shí)，充分混勻水樣備用即可。當(dāng)每張紙片接種水樣量小于1ml時(shí)，水樣應(yīng)制成稀釋樣品后使用。接種量為0.1ml、0.01ml時(shí)，分別制成1:10稀釋樣品、1:100稀釋樣品。其他接種量的稀釋樣品依次類推。1:10稀釋樣品的制作方法為：吸取1mil水樣，注入盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混勻，制成1:10稀釋樣品。其他稀釋度的稀釋樣品同法制作。7.2水樣接種7.2.1接種量每個(gè)樣品按三個(gè)10倍遞減的不同接種量接種，每個(gè)接種量分別接種5張紙片，共接種15張紙片。根據(jù)水樣的污染程度確定接種量，應(yīng)盡可能使5個(gè)接種量最大的紙片為陽(yáng)性、5個(gè)接種量最小的紙片為陰性，避免出現(xiàn)所有三個(gè)不同接種量共15張紙片全部為陽(yáng)性或者全部為陰性。清潔水樣的參考接種量分別為10ml、1ml、0.1ml,受污染水樣參考接種量根據(jù)污染程度可接種1ml、0.1ml、0.01ml或0.1ml、0.01ml、0.001ml等，見表1。清潔水樣，接種水樣總量為55.5ml,10ml水樣量紙片5張，每張接種水樣10ml,1ml水樣量紙片10張，其中5張各接種水樣1ml,另5張各接種1:10的稀釋水樣1ml。受污染水樣，接種3個(gè)不同稀釋度的1ml稀釋水樣各5張。4表1水樣接種量參考表1▲▲▲▲▲▲▲▲▲醫(yī)療機(jī)構(gòu)排放污水(處理后)▲▲▲畜禽養(yǎng)殖業(yè)等排放廢水▲▲接種水樣應(yīng)均勻滴加在紙片上，紙片充分浸潤(rùn)、吸收水樣，用手在聚丙烯塑膜袋外側(cè)輕輕撫平，做好標(biāo)記。檢測(cè)總大腸菌群時(shí)，在37℃±1℃的條件下培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果；檢測(cè)糞大腸菌群時(shí)，在44.5℃±0.5℃的條件下培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果。7.4對(duì)照試驗(yàn)7.4.1空白對(duì)照用無(wú)菌水做全程序空白測(cè)定，培養(yǎng)后的紙片上不得有任何顏色反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。7.4.2陽(yáng)性及陰性對(duì)照總大腸菌群測(cè)定的陽(yáng)性菌株為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli),陰性菌株為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);糞大腸菌群測(cè)定的陽(yáng)性菌株為大腸埃希氏菌(EScherichiacoli),陰性菌株為產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)。上述標(biāo)準(zhǔn)菌株均制成濃度為300～3000個(gè)/ml的菌懸液，分別取相應(yīng)水量的菌懸液接種紙片，陽(yáng)性與陰性菌株各5張，按7.3要求培養(yǎng)，大腸埃希氏菌應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。稀釋至300～3000個(gè)/ml。7.5結(jié)果判讀(1)紙片上出現(xiàn)紅斑或紅暈且周圍變黃，為陽(yáng)性。(2)紙片全片變黃，無(wú)紅斑或紅暈，為陽(yáng)性。(3)紙片部分變黃，無(wú)紅斑或紅暈，為陰性。(4)紙片的紫色背景上出現(xiàn)紅斑或紅暈，而周圍不變黃，為陰性。(5)紙片無(wú)變化，為陰性。結(jié)果判讀參照?qǐng)D片見附錄A。5根據(jù)不同接種量的陽(yáng)性紙片數(shù)量，查MPN表(附錄B)得到MPN值(MPN/100ml),按式(1)換算并報(bào)告1L水樣中總大腸菌群或糞大腸菌群數(shù)：100——10×10ml,其中，10將MPN值的單位MPN/100ml轉(zhuǎn)換為MPN/L,10ml為MPN表中測(cè)定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，大于等于100時(shí)以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示，結(jié)果的單位為MPN/L。平均值微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，按其統(tǒng)計(jì)分析要求，其檢測(cè)結(jié)果全部經(jīng)對(duì)數(shù)(以10為底)轉(zhuǎn)換后進(jìn)6家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(15600MPN/L)、低濃度(4.0×102MPN/L)、中濃度(1.0×10?分別為4.5%～7.5%、3.5%～12.4%、4.5%～6.9%、2.8%～5.8%;實(shí)驗(yàn)室間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.3%、 6家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(12100MPN/L)、低濃分別為4.5%～11.3%、11.4%～31.3%、2.8%～21.5%、3.9%～13.2%;實(shí)驗(yàn)室間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.2%、14.8%、11.9%、8.2%。重復(fù)性限分別為0.93、0.83、0.85、0.77;再現(xiàn)性限分別為1.286家實(shí)驗(yàn)室對(duì)總大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(15600MPN/L)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)誤差的范圍是-5.5%～-12.8%,相對(duì)誤差的最終值為-8.8%±6.0%。6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)糞大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(12100MPN/L)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)誤差的范圍是-3.8%～-16.0%,相對(duì)誤差的最終值為-10.3%±9.2%。610質(zhì)量保證和質(zhì)量控制10.1必須使用質(zhì)量鑒定合格的紙片。10.2每批樣品按7.4進(jìn)行全程序空白測(cè)定，并使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽(yáng)性、陰性對(duì)照試驗(yàn)。11廢物處理使用后的器皿及廢棄物須經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min后，器皿方可清洗，廢棄物作為一般廢物處置。7(資料性附錄)結(jié)果判定參考圖片(紙片上出現(xiàn)紅斑或紅暈且周圍變黃)(紙片全片變黃，無(wú)紅斑或紅暈)(紙片無(wú)變化)(紙片部分變黃，無(wú)紅班或紅暈)(紙片的紫色背景上出現(xiàn)紅斑或紅暈，而周圍不變黃)8(水樣接種量為5份10ml,5份1ml,5份0.1ml)下限下限00002600270380024704003505004704005916010272801143012611401371504920601521810204222021623022724023925024308102531203063203733032934033350344020351410408142049143042440434504450045505095205153052540535505420050552071002720292101420339下限下限204325205322621073232192324212332521333052143317253322209233322133342224335223340722434182253422303343234344232345233350823435123535224043532413542423552434003