【生物】目的基因的檢測(cè)與鑒定課件-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性；2.檢測(cè)內(nèi)容及方法:類型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀病原體接種實(shí)驗(yàn)等1.目的:目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定基因是否插入染色體DNA（存在）方法1：PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因生物提取DNADNA作為模板PCR操作是否擴(kuò)增出目的基因電泳操作M：marker；1-陽(yáng)性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(1)首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；(2)將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記，以此做探針；(3)使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交，若顯示出雜交帶，表明染色體已插入染色體DNA中?；蛱结?簡(jiǎn)稱探針，是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記（同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑），且順序已知的，與目的基因互補(bǔ)核酸序列(DNA或RNA)。目的基因的檢測(cè)與鑒定基因是否插入染色體DNA（存在）方法2：DNA分子雜交技術(shù)目的基因的檢測(cè)與鑒定基因是否插入染色體DNA（存在）原因：帶標(biāo)記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。方法2：DNA分子雜交技術(shù)目的基因的檢測(cè)與鑒定

基因是否轉(zhuǎn)錄（mRNA）轉(zhuǎn)基因生物PCR操作是否擴(kuò)增出目的基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA提取RNAmRNA作為模板RNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖提取RNA轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)記的基因探針方法1：PCR擴(kuò)增方法2：RNA分子雜交技術(shù)目的基因的檢測(cè)與鑒定

基因是否翻譯（蛋白質(zhì)）抗原-抗體雜交技術(shù)蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交脫分化(WesternBlot)流程圖從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)。檢測(cè)蛋白質(zhì):抗原和抗體雜交四、第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)方法觀察指標(biāo)抗蟲植物害蟲吞食害蟲死亡抗病毒(菌)植物病毒(菌)感染未侵染上病斑抗鹽植物鹽水澆灌正常生長(zhǎng)抗除草劑植物噴灑除草劑正常生長(zhǎng)獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較細(xì)胞產(chǎn)物功能活性正常常見轉(zhuǎn)基因生物在個(gè)體水平上鑒定、檢測(cè)的方法（列舉如下表）目的基因的檢測(cè)與鑒定類型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR、核酸分子雜交技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等檢測(cè)內(nèi)容及方法（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入到某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入到四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。雙抗性實(shí)驗(yàn)——個(gè)體水平重組體的篩選方法（2）受體細(xì)胞可能有：①含目的基因的細(xì)菌——無抗性②含目的基因—目的基因的細(xì)菌——無抗性③含質(zhì)粒的細(xì)菌——有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性④含質(zhì)粒—質(zhì)粒的細(xì)菌——有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性⑤含重組質(zhì)粒的細(xì)菌——有氨芐青霉素抗性雙抗性實(shí)驗(yàn)——個(gè)體水平重組體的篩選方法（3）篩選方法：①將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌放在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)?！|(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落；②再利用滅菌的絨布影印到含四環(huán)素培養(yǎng)基上，不生長(zhǎng)的即為含目的基因的菌落，如圖1、5。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。雙抗性實(shí)驗(yàn)——個(gè)體水平重組體的篩選方法雙抗性實(shí)驗(yàn)——個(gè)體水平重組體的篩選方法例1.(2016·全國(guó)卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因,Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后,與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合,加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng),用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌,結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化,有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種,分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}:雙抗性實(shí)驗(yàn)——個(gè)體水平重組體的篩選方法(1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具,應(yīng)具備的基本條件有

。而作為基因表達(dá)載體,除滿足上述基本條件外,還需具有啟動(dòng)子和終止子。(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中,未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的,其原因是

;并且含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或含有重組質(zhì)粒)的細(xì)胞也是不能區(qū)分的,其原因是

。在上述篩選的基礎(chǔ)上,若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落,還需使用含有

的固體培養(yǎng)基。二者均不含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)；二者均含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)；四環(huán)素利用特定表型：藍(lán)白斑篩選——個(gè)體水平重組體的篩選方法重組體的篩選方法大腸桿菌的質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ基因，其編碼的產(chǎn)物β－半乳糖苷酶在X－gal和IPTG同時(shí)存在時(shí)，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色。如圖為利用該質(zhì)粒進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因過程，請(qǐng)據(jù)圖判斷菌落①②③的顏色分別是（)A.藍(lán)色白色白色B.藍(lán)色藍(lán)色白色C.藍(lán)色白色藍(lán)色D.白色藍(lán)色白色利用特定表型：藍(lán)白斑篩選——個(gè)體水平重組體的篩選方法利用特定表型：藍(lán)白斑篩選——個(gè)體水平雙酶切法——分子水平重組體的篩選方法載體和CD14片段的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切抗性基因序列如圖1所示。用XhoI和SalI分別酶切CD14和載體后連接，CD14接入載體時(shí)會(huì)形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA可進(jìn)一步用這兩種限制酶對(duì)CD14的連接方向進(jìn)行鑒定，理由是

。PCR法——分子水平重組體的篩選方法(2019·江蘇高考·節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒,擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置,PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是

。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段,原因是

。乙丙目的基因反向連接PCR法——分子水平重組體的篩選方法(2019·天津高考·節(jié)選)B基因存在于水稻基因組中,其僅在體細(xì)胞(2n)和精子中正常表達(dá),但在卵細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄。為研究B基因表達(dá)對(duì)卵細(xì)胞的影響,設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)。PCR法——分子水平重組體的篩選方法獲得轉(zhuǎn)基因植株過程中,以下鑒定篩選方式正確的是

(多選)。

A.將隨機(jī)斷裂的B基因片段制備成探針進(jìn)行DNA分子雜交B.以Luc基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)探針進(jìn)行DNA分子雜交C.以B基因編碼蛋白的序列為模板設(shè)計(jì)探針與從卵細(xì)胞提取的mRNA雜交D.檢測(cè)加入熒光素的卵細(xì)胞中是否發(fā)出熒光BCD小結(jié)1.目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴(kuò)增化學(xué)方法人工合成2.構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-關(guān)鍵農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動(dòng)物)、

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(