硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）活性測定試劑盒說明書

第第頁硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）活性測定試劑盒說明書硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）活性測定試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個(gè)預(yù)期差別大的樣本做猜測定。測定意義：TPX屬于過氧化物酶家族，在體內(nèi)重要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，功能與GPX仿佛，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一、TPX普遍存在于各種生物體內(nèi)，如酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲、細(xì)菌和古細(xì)菌，在進(jìn)化上高度保守。TPX與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控緊密相關(guān)。TPX的重要功能包含細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)整由過氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。測定原理：TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇（DTT），H2O2的汲取波長為240nm，通過測定240nm吸光度的下降速率，即可計(jì)算出TPX活性。自備儀器和用品:低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)整移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）和蒸餾水試劑組成和配制:試劑一：液體120mL×1瓶，室溫保管。試劑二：液體20mL×1瓶，20℃保管。試劑三：液體2mL×1支，4℃。粗酶液提?。?.組織：依照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。2.細(xì)菌、真菌：依照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。3.血清等液體：直接測定。TPX測定操作：取微量石英比色皿或96孔板，加入4μL上清液，180μL試劑二，16μL試劑三，快速混勻后于240nm測定10s和130s吸光度，記為A1和A2、TPX活性計(jì)算公式：a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下（1）.按蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolH2O2降解為1個(gè)酶活單位。TPX（nmol/min/mgprot）=（A1—A2）÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=573×（A1—A2）÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmolH2O2降解為1個(gè)酶活單位。TPX活性（nmol/min/g鮮重）=（A1—A2）÷ε÷d×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=573×（A1—A2）÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolH2O2降解為1個(gè)酶活單位。TPX活性（nmol/min/104cell）=（A1—A2）÷ε÷d×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=573×（A1—A2）÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmolH2O2降解為1個(gè)酶活單位。TPX活性（nmol/min/mL）=（A1—A2）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T=573×（A1—A2）ε：H2O2的摩爾消光系數(shù)，43600L/mol/cm=0.0436L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×104L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；W：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），4μL=4×103mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min。b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下（1）.按蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolH2O2降解為1個(gè)酶活單位。TPX活性（nmol/min/mgprot）=（A1—A2）÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=1146×（A1—A2）÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmolH2O2降解為1個(gè)酶活單位。TPX活性（nmol/min/g鮮重）=（A1—A2）÷ε÷d×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=1146×（A1—A2）÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolH2O2降解為1個(gè)酶活單位。TPX活性（nmol/min/104cell）=（A1—A2）÷ε÷d×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=1146×（A1—A2）÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmolH2O2降解為1個(gè)酶活單位。TPX活性（nmol/min/mL）=（A1—A2）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T=1146×（A1—A2）ε：H2O2的摩爾消光系數(shù)，43600L/mol/cm=0.0436L/μmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），2