基因工程實(shí)驗(yàn)課

基因工程實(shí)驗(yàn)課（2）基因工程流程第一次課程：質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化重組菌的篩選挑取單克隆培養(yǎng)第二次課程：質(zhì)粒的提取質(zhì)粒的濃度測(cè)定質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒的酶切基因工程實(shí)驗(yàn)報(bào)告重要數(shù)據(jù)挑單克隆后進(jìn)行液體培養(yǎng)的培養(yǎng)物；RFP重組菌液在IPTG/AmpLB平板上畫圖案；質(zhì)粒轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)化中涂平板后的培養(yǎng)結(jié)果；瓊糖脂凝膠電泳圖譜；DNA濃度測(cè)定表。第二次課程：1.質(zhì)粒的酶切2.質(zhì)粒的提取3.質(zhì)粒的電泳4.質(zhì)粒的濃度測(cè)定第二次課程：1.質(zhì)粒的酶切2.質(zhì)粒的提取3.質(zhì)粒的電泳4.質(zhì)粒的濃度測(cè)定DNA的限制性內(nèi)切酶鑒定EcoRIBamHIEcoRI質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶鑒定質(zhì)粒BamHIMarkerEcoRI+BamHI質(zhì)粒可能有3種構(gòu)型及遷移率：1.共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒，最快；2.線狀質(zhì)粒DNA，次之；3.開環(huán)質(zhì)粒DNA，最慢。酶貯存液特別注意:[1]吸取準(zhǔn)確體積的酶；[2]甘油粘稠！3-9是影響限制酶活性的重要因素。緩沖液(Buffer)緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。組分

體積

RFP質(zhì)粒

(~500ng)5

l10xbufferK2

lEcoRI1.5

lBamHI1.5

lH2O10

l表1：酶切反應(yīng)體系酶切反應(yīng)體系充分混勻，37℃1~2小時(shí)，加入2.5

l10xLoadingbuffer終止酶切，進(jìn)行1%Agarose電泳檢測(cè)。特別注意:[1]吸取準(zhǔn)確體積的酶；[2]甘油粘稠！第二次課程：1.質(zhì)粒的酶切2.質(zhì)粒的提取3.質(zhì)粒的電泳4.質(zhì)粒的濃度測(cè)定質(zhì)粒的提取——堿裂解法SolutionI:250

l，重懸菌體SolutionII:250

l，裂解(NaOH/SDS)SolutionIII：350

l，中和（醋酸鉀）ElutionBuffe：

50

l，洗脫質(zhì)粒觀看視頻…第二次課程：1.質(zhì)粒的酶切2.質(zhì)粒的提取3.質(zhì)粒的電泳4.質(zhì)粒的濃度測(cè)定3-153-16瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖(Agarose)2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。是一種線性多糖聚合物，從海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高空隙小瓊脂粉(Agar)3-173-18瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大?。╞p）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。3.瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力。3-19優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大?。╞p）4.010.020.01000—100500—2550—1聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳：1000—50000bp聚丙烯酰胺凝膠電泳：1—1000bp3-20凝膠染色1.染料溴化乙錠。Ethidiumbromide（EB）強(qiáng)致癌劑！??！佩戴手套，特別小心！3-21EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。2.原理3-22UVP全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)3-23標(biāo)準(zhǔn)分子量DNAmarker3-24

DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜（舉例）觀看視頻…3-26配置1%的agrose（1）稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30mLTAE，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻；（2）有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子；（3）向冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液中加入1.5μl溴化乙錠(EB)試劑，(注意不要形成氣泡)；待膠凝固后，取出梳子，并放在電泳槽內(nèi)，加人電泳緩沖液至電泳槽中；準(zhǔn)備上樣電泳。質(zhì)粒的電泳上樣順序質(zhì)粒MarkerEcoRI+BamHIMarker:5μl質(zhì)粒：400ng酶切產(chǎn)物：20μl注意：質(zhì)粒要加入2-3

l10xLoadingbuffer，混勻后再上樣第二次課程：1.質(zhì)粒的酶切2.質(zhì)粒的提取3.質(zhì)粒的電泳4.質(zhì)粒的濃度測(cè)定核酸在波長(zhǎng)260nm

處有強(qiáng)烈的吸收，是由堿基的共軛雙鍵所決定的。這一特性常用作核酸的定性和定量分析。核酸分子具有強(qiáng)烈的紫外吸收DNA或RNA的定量A260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA(dsDNA)40μg