臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢專家講座

臨床PCR試劑盒選取和質(zhì)檢衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心李金明臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第1頁(yè)P(yáng)CR或RT-PCR試劑盒組成核酸提取試劑核酸擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴(kuò)增試劑產(chǎn)物檢測(cè)試劑（有些使用全自動(dòng)分析儀PCR方法因其核酸擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)完成，故無(wú)專門(mén)產(chǎn)物檢測(cè)試劑）臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第2頁(yè)影響PCR試劑盒質(zhì)量原因內(nèi)在原因:原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì)臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第3頁(yè)影響PCR試劑盒質(zhì)量原因：

擴(kuò)增所需原材料寡核苷酸引物和探針緩沖液和dNTP聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第4頁(yè)P(yáng)CR反應(yīng)混合物

Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase

生物素標(biāo)記引物和或和臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第5頁(yè)寡核苷酸引物和探針其對(duì)試劑盒質(zhì)量影響首先是純度。純度判斷可依據(jù)260/280吸光度比值來(lái)判斷，如?2.0，則需重新純化。另一個(gè)方法是將其在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如出現(xiàn)一條以上帶或遷移位置錯(cuò)誤，則需重新純化。是否有污染。結(jié)合特異性（濃度）臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第6頁(yè)dNTP和緩沖液dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP）濃度緩沖液：在儲(chǔ)存和擴(kuò)增循環(huán)中穩(wěn)定、作為聚合酶活性所必須Mg＋＋（或用于rTthMn＋＋）濃度以及pH等臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第7頁(yè)逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶酶濃度酶活性臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第8頁(yè)核酸擴(kuò)增方法PCRRT－PCR轉(zhuǎn)錄依賴擴(kuò)增（TMA）連接酶鏈反應(yīng)（LCR）鏈替換擴(kuò)增（SDA）等臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第9頁(yè)影響PCR試劑盒質(zhì)量原因：

核酸提取核酸提取有效性核酸提取簡(jiǎn)便性臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第10頁(yè)臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第11頁(yè)臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第12頁(yè)臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第13頁(yè)影響PCR試劑盒質(zhì)量原因：產(chǎn)物檢測(cè)雜交固相特異探針及其標(biāo)識(shí)物臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第14頁(yè)臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第15頁(yè)臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第16頁(yè)影響PCR試劑盒質(zhì)量原因內(nèi)在原因:原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì)外在原因：試劑盒運(yùn)輸和貯存外在原因：試劑盒運(yùn)輸和貯存臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第17頁(yè)試劑盒運(yùn)輸和貯存PCR試劑盒使用期普通為6個(gè)月，這是指在適當(dāng)貯存溫度下。核酸擴(kuò)增部分試劑普通要貯存于-20℃下；產(chǎn)物檢測(cè)部分試劑則貯存于2～8℃。試劑盒從廠家到用戶手中，均要經(jīng)歷運(yùn)輸及運(yùn)輸中貯存，任一步驟不妥，均會(huì)影響試劑盒臨床使用質(zhì)量。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第18頁(yè)P(yáng)CR試劑盒分類(lèi)定性測(cè)定：PCR-ELISA、PCR-膜上雜交（雜交梳）、熒光PCR（分子信標(biāo)和TaqMan等）定量測(cè)定：PCR-ELISA、TaqMan和Amplisensor熒光定量、AmplicorPCR-ELISA定量等。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第19頁(yè)P(yáng)CR試劑盒選取標(biāo)準(zhǔn)參考試劑生產(chǎn)廠家信息廣告參考同行對(duì)相關(guān)試劑盒使用效果參考相關(guān)機(jī)構(gòu)綜合評(píng)價(jià)依據(jù)使用目標(biāo)依據(jù)所在試驗(yàn)室技術(shù)特點(diǎn)依據(jù)所在醫(yī)院患者承受能力臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第20頁(yè)P(yáng)CR試劑盒質(zhì)檢外包裝：廠家名稱、檢測(cè)目標(biāo)、同意文號(hào)、批號(hào)和使用期等。內(nèi)包裝：試劑瓶是否漏液、真空包裝是否破損以、試劑是否齊全以及是否有使用說(shuō)明書(shū)等。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第21頁(yè)P(yáng)CR試劑盒質(zhì)檢(定性測(cè)定)性能質(zhì)檢采取血清（樣本）盤(pán)（Panel）質(zhì)檢：PCR試劑血清（樣本）盤(pán)由一定數(shù)量原血清陰、陽(yáng)性樣本、2～3份純化核酸（DNA或RNA或cDNA）樣本以及3～5份系列稀釋陽(yáng)性樣本所組成。樣本總數(shù)可定在20份左右。原血清樣本用于判斷試劑盒對(duì)特定病原體核酸檢出特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣本用于判斷DNA擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄及DNA擴(kuò)增有效性；系列稀釋陽(yáng)性樣本用于判斷試劑測(cè)定下限。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第22頁(yè)試劑特異性、靈敏度和符合率計(jì)算公式臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第23頁(yè)試劑特異性、靈敏度和符合率計(jì)算公式靈敏度（％）＝(a/a+c)100%特異性（％）＝(d/b+d)100%符合率（％）＝(a+d/a+b+c+d)100%臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第24頁(yè)P(yáng)CR試劑盒質(zhì)檢(定量測(cè)定)樣本：已知濃度高、中、低三種濃度質(zhì)控物。質(zhì)檢內(nèi)容：測(cè)定重復(fù)性測(cè)定范圍抗干擾能力臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第25頁(yè)技術(shù)驗(yàn)收依據(jù)：《臨床檢驗(yàn)擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室管理暫行方法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[]10號(hào)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字第8號(hào)臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第26頁(yè)技術(shù)驗(yàn)收內(nèi)容試驗(yàn)室設(shè)置和設(shè)備設(shè)施和環(huán)境人員設(shè)備管理檢測(cè)方法標(biāo)本管理統(tǒng)計(jì)匯報(bào)質(zhì)量控制埋怨等十章共三十八條臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第27頁(yè)試驗(yàn)室設(shè)置和設(shè)備本章共七條。試驗(yàn)室分區(qū)：規(guī)范化分區(qū)、明確識(shí)別標(biāo)識(shí)防污染：空氣流向、中央空調(diào)、各區(qū)間封閉性各區(qū)儀器設(shè)備物品配置：充分性、科學(xué)性、專用性（標(biāo)識(shí)）

“生物安全柜”“可移動(dòng)紫外燈”“加樣器”臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第28頁(yè)設(shè)施和環(huán)境本章包含五條；試驗(yàn)室設(shè)施、工作區(qū)域、能源、照明等；環(huán)境和試驗(yàn)條件控制設(shè)施：溫濕度計(jì)、不間斷或穩(wěn)壓電源等；試驗(yàn)室進(jìn)出限制和控制：人員進(jìn)入控制標(biāo)識(shí)、生物傳染危險(xiǎn)性標(biāo)識(shí)試驗(yàn)室“內(nèi)務(wù)管理”（如人員流動(dòng)、清潔等）制度和對(duì)應(yīng)設(shè)施；廢棄血清處理、生物防護(hù)等辦法和對(duì)應(yīng)設(shè)施臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第29頁(yè)設(shè)施和環(huán)境需注意問(wèn)題清潔程序或制度

清潔用具專用、清潔工作單一流向、清潔方法詳細(xì)性生物防護(hù)及廢棄血清處理對(duì)工作人員保護(hù)和對(duì)環(huán)境保護(hù)

銳器使用規(guī)則生物傳染危險(xiǎn)性廢棄物出試驗(yàn)室前預(yù)處理臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第30頁(yè)人員本章包含三條。人員數(shù)量足夠；有培訓(xùn)上崗證培訓(xùn)計(jì)劃：室內(nèi)定時(shí)培訓(xùn)（統(tǒng)計(jì)）人員技術(shù)（資格、培訓(xùn)、技能）檔案。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第31頁(yè)設(shè)備管理（1）本章包含三條。主要儀器設(shè)備應(yīng)得到正確維護(hù)，應(yīng)有設(shè)備維護(hù)程序文件；以及維護(hù)統(tǒng)計(jì)加樣器、溫度計(jì)、擴(kuò)增儀和酶標(biāo)儀等設(shè)備應(yīng)有校準(zhǔn)程序文件、有顯著標(biāo)識(shí)表明其校準(zhǔn)狀態(tài)（此次校按時(shí)間及下次應(yīng)校按時(shí)間）；試驗(yàn)室應(yīng)保留每一臺(tái)儀器設(shè)備檔案材料，對(duì)檔案材料詳細(xì)內(nèi)容作了詳細(xì)要求。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第32頁(yè)設(shè)備和質(zhì)控物（2）每一臺(tái)設(shè)備檔案內(nèi)容包含：（a）設(shè)備名稱；（b）制造商名稱、型號(hào)、序號(hào)等；（c）接收日期和啟用日期；（d）當(dāng)前放置地點(diǎn)；（e）接收時(shí)狀態(tài)；（f）儀器使用說(shuō)明書(shū)有復(fù)印件；（g）校準(zhǔn)和/或檢定日期和結(jié)果及下次校準(zhǔn)和/或檢定日期；（h）迄今所進(jìn)行維護(hù)和今后維護(hù)計(jì)劃細(xì)節(jié)；（i）損壞、故障、改裝或修理歷史。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第33頁(yè)檢測(cè)方法本章包含三條。標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）：儀器設(shè)備操作和校準(zhǔn)程序；標(biāo)本搜集處理程序；擴(kuò)增檢測(cè)工作程序；儀器試劑選購(gòu)和質(zhì)檢程序；消耗性材料購(gòu)置、驗(yàn)收、質(zhì)檢和貯存程序。SOP應(yīng)現(xiàn)行有效及便于使用。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第34頁(yè)標(biāo)本管理本章包含五條。建立唯一編號(hào)識(shí)別系統(tǒng)，防止標(biāo)本混同；標(biāo)本采集、運(yùn)輸和保留程序；標(biāo)本接收時(shí)狀態(tài)統(tǒng)計(jì)；標(biāo)本適用性和充分性；標(biāo)本貯存標(biāo)準(zhǔn)操作程序及貯存溫度控制辦法;標(biāo)本接收及安全處置程序；維護(hù)試驗(yàn)室老實(shí)性必要辦法。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第35頁(yè)記錄本章包含三條。有統(tǒng)計(jì)管理制度：適合本身實(shí)際情況，符合現(xiàn)行規(guī)章制度；（由誰(shuí)管、在何處管、保留多長(zhǎng)時(shí)間）原始統(tǒng)計(jì)、計(jì)算和導(dǎo)出數(shù)據(jù)應(yīng)歸檔并保留；統(tǒng)計(jì)應(yīng)有相關(guān)人員簽字；全部統(tǒng)計(jì)和匯報(bào)都要妥善保管并保密。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第36頁(yè)報(bào)告檢測(cè)結(jié)果匯報(bào)應(yīng)準(zhǔn)確、清楚和客觀；定性測(cè)定匯報(bào)“陰性”或“陽(yáng)性”；定量測(cè)定則以拷貝數(shù)/ml或IU/ml匯報(bào)；防止二者之間混同；每份匯報(bào)應(yīng)包含以下信息：標(biāo)題、唯一標(biāo)識(shí)、檢測(cè)標(biāo)本說(shuō)明、標(biāo)本特征和狀態(tài)、標(biāo)本接收日期和檢測(cè)日期、檢測(cè)方法、檢測(cè)和校核人員簽字及發(fā)出日期、參考結(jié)果或范圍；如對(duì)匯報(bào)有效性有疑問(wèn)，試驗(yàn)室應(yīng)馬上通知臨床相關(guān)科室給予更正程序；有匯報(bào)發(fā)放程序：用電話、傳真、電子郵件匯報(bào)結(jié)果時(shí)保密標(biāo)準(zhǔn)。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第37頁(yè)質(zhì)量控制試驗(yàn)室應(yīng)有室內(nèi)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序

質(zhì)控物起源、濃度、批號(hào)陰性質(zhì)控設(shè)置所選擇統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法（均值、SD怎樣得到）失控判斷標(biāo)準(zhǔn)失控以后怎么辦試驗(yàn)室應(yīng)參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢第38頁(yè)抱怨試驗(yàn)室應(yīng)制訂埋怨及其處理SOP；

可操作性、不一樣埋怨處理如埋怨包括到工