臨床PCR試劑盒的選用和質檢專家講座

臨床PCR試劑盒選取和質檢衛(wèi)生部臨床檢驗中心李金明臨床PCR試劑盒的選用和質檢第1頁PCR或RT-PCR試劑盒組成核酸提取試劑核酸擴增或逆轉錄-核酸擴增試劑產(chǎn)物檢測試劑（有些使用全自動分析儀PCR方法因其核酸擴增和檢測同時完成，故無專門產(chǎn)物檢測試劑）臨床PCR試劑盒的選用和質檢第2頁影響PCR試劑盒質量原因內(nèi)在原因:原材料、核酸提取方法、方法學設計臨床PCR試劑盒的選用和質檢第3頁影響PCR試劑盒質量原因：

擴增所需原材料寡核苷酸引物和探針緩沖液和dNTP聚合酶、逆轉錄酶等臨床PCR試劑盒的選用和質檢第4頁PCR反應混合物

Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase

生物素標記引物和或和臨床PCR試劑盒的選用和質檢第5頁寡核苷酸引物和探針其對試劑盒質量影響首先是純度。純度判斷可依據(jù)260/280吸光度比值來判斷，如?2.0，則需重新純化。另一個方法是將其在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如出現(xiàn)一條以上帶或遷移位置錯誤，則需重新純化。是否有污染。結合特異性（濃度）臨床PCR試劑盒的選用和質檢第6頁dNTP和緩沖液dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP）濃度緩沖液：在儲存和擴增循環(huán)中穩(wěn)定、作為聚合酶活性所必須Mg＋＋（或用于rTthMn＋＋）濃度以及pH等臨床PCR試劑盒的選用和質檢第7頁逆轉錄酶、DNA聚合酶酶濃度酶活性臨床PCR試劑盒的選用和質檢第8頁核酸擴增方法PCRRT－PCR轉錄依賴擴增（TMA）連接酶鏈反應（LCR）鏈替換擴增（SDA）等臨床PCR試劑盒的選用和質檢第9頁影響PCR試劑盒質量原因：

核酸提取核酸提取有效性核酸提取簡便性臨床PCR試劑盒的選用和質檢第10頁臨床PCR試劑盒的選用和質檢第11頁臨床PCR試劑盒的選用和質檢第12頁臨床PCR試劑盒的選用和質檢第13頁影響PCR試劑盒質量原因：產(chǎn)物檢測雜交固相特異探針及其標識物臨床PCR試劑盒的選用和質檢第14頁臨床PCR試劑盒的選用和質檢第15頁臨床PCR試劑盒的選用和質檢第16頁影響PCR試劑盒質量原因內(nèi)在原因:原材料、核酸提取方法、方法學設計外在原因：試劑盒運輸和貯存外在原因：試劑盒運輸和貯存臨床PCR試劑盒的選用和質檢第17頁試劑盒運輸和貯存PCR試劑盒使用期普通為6個月，這是指在適當貯存溫度下。核酸擴增部分試劑普通要貯存于-20℃下；產(chǎn)物檢測部分試劑則貯存于2～8℃。試劑盒從廠家到用戶手中，均要經(jīng)歷運輸及運輸中貯存，任一步驟不妥，均會影響試劑盒臨床使用質量。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第18頁PCR試劑盒分類定性測定：PCR-ELISA、PCR-膜上雜交（雜交梳）、熒光PCR（分子信標和TaqMan等）定量測定：PCR-ELISA、TaqMan和Amplisensor熒光定量、AmplicorPCR-ELISA定量等。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第19頁PCR試劑盒選取標準參考試劑生產(chǎn)廠家信息廣告參考同行對相關試劑盒使用效果參考相關機構綜合評價依據(jù)使用目標依據(jù)所在試驗室技術特點依據(jù)所在醫(yī)院患者承受能力臨床PCR試劑盒的選用和質檢第20頁PCR試劑盒質檢外包裝：廠家名稱、檢測目標、同意文號、批號和使用期等。內(nèi)包裝：試劑瓶是否漏液、真空包裝是否破損以、試劑是否齊全以及是否有使用說明書等。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第21頁PCR試劑盒質檢(定性測定)性能質檢采取血清（樣本）盤（Panel）質檢：PCR試劑血清（樣本）盤由一定數(shù)量原血清陰、陽性樣本、2～3份純化核酸（DNA或RNA或cDNA）樣本以及3～5份系列稀釋陽性樣本所組成。樣本總數(shù)可定在20份左右。原血清樣本用于判斷試劑盒對特定病原體核酸檢出特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣本用于判斷DNA擴增或逆轉錄及DNA擴增有效性；系列稀釋陽性樣本用于判斷試劑測定下限。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第22頁試劑特異性、靈敏度和符合率計算公式臨床PCR試劑盒的選用和質檢第23頁試劑特異性、靈敏度和符合率計算公式靈敏度（％）＝(a/a+c)100%特異性（％）＝(d/b+d)100%符合率（％）＝(a+d/a+b+c+d)100%臨床PCR試劑盒的選用和質檢第24頁PCR試劑盒質檢(定量測定)樣本：已知濃度高、中、低三種濃度質控物。質檢內(nèi)容：測定重復性測定范圍抗干擾能力臨床PCR試劑盒的選用和質檢第25頁技術驗收依據(jù)：《臨床檢驗擴增檢驗試驗室管理暫行方法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[]10號《臨床基因擴增檢驗試驗室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字第8號臨床PCR試劑盒的選用和質檢第26頁技術驗收內(nèi)容試驗室設置和設備設施和環(huán)境人員設備管理檢測方法標本管理統(tǒng)計匯報質量控制埋怨等十章共三十八條臨床PCR試劑盒的選用和質檢第27頁試驗室設置和設備本章共七條。試驗室分區(qū)：規(guī)范化分區(qū)、明確識別標識防污染：空氣流向、中央空調(diào)、各區(qū)間封閉性各區(qū)儀器設備物品配置：充分性、科學性、專用性（標識）

“生物安全柜”“可移動紫外燈”“加樣器”臨床PCR試劑盒的選用和質檢第28頁設施和環(huán)境本章包含五條；試驗室設施、工作區(qū)域、能源、照明等；環(huán)境和試驗條件控制設施：溫濕度計、不間斷或穩(wěn)壓電源等；試驗室進出限制和控制：人員進入控制標識、生物傳染危險性標識試驗室“內(nèi)務管理”（如人員流動、清潔等）制度和對應設施；廢棄血清處理、生物防護等辦法和對應設施臨床PCR試劑盒的選用和質檢第29頁設施和環(huán)境需注意問題清潔程序或制度

清潔用具專用、清潔工作單一流向、清潔方法詳細性生物防護及廢棄血清處理對工作人員保護和對環(huán)境保護

銳器使用規(guī)則生物傳染危險性廢棄物出試驗室前預處理臨床PCR試劑盒的選用和質檢第30頁人員本章包含三條。人員數(shù)量足夠；有培訓上崗證培訓計劃：室內(nèi)定時培訓（統(tǒng)計）人員技術（資格、培訓、技能）檔案。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第31頁設備管理（1）本章包含三條。主要儀器設備應得到正確維護，應有設備維護程序文件；以及維護統(tǒng)計加樣器、溫度計、擴增儀和酶標儀等設備應有校準程序文件、有顯著標識表明其校準狀態(tài)（此次校按時間及下次應校按時間）；試驗室應保留每一臺儀器設備檔案材料，對檔案材料詳細內(nèi)容作了詳細要求。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第32頁設備和質控物（2）每一臺設備檔案內(nèi)容包含：（a）設備名稱；（b）制造商名稱、型號、序號等；（c）接收日期和啟用日期；（d）當前放置地點；（e）接收時狀態(tài)；（f）儀器使用說明書有復印件；（g）校準和/或檢定日期和結果及下次校準和/或檢定日期；（h）迄今所進行維護和今后維護計劃細節(jié)；（i）損壞、故障、改裝或修理歷史。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第33頁檢測方法本章包含三條。標準操作程序（SOP）：儀器設備操作和校準程序；標本搜集處理程序；擴增檢測工作程序；儀器試劑選購和質檢程序；消耗性材料購置、驗收、質檢和貯存程序。SOP應現(xiàn)行有效及便于使用。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第34頁標本管理本章包含五條。建立唯一編號識別系統(tǒng)，防止標本混同；標本采集、運輸和保留程序；標本接收時狀態(tài)統(tǒng)計；標本適用性和充分性；標本貯存標準操作程序及貯存溫度控制辦法;標本接收及安全處置程序；維護試驗室老實性必要辦法。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第35頁記錄本章包含三條。有統(tǒng)計管理制度：適合本身實際情況，符合現(xiàn)行規(guī)章制度；（由誰管、在何處管、保留多長時間）原始統(tǒng)計、計算和導出數(shù)據(jù)應歸檔并保留；統(tǒng)計應有相關人員簽字；全部統(tǒng)計和匯報都要妥善保管并保密。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第36頁報告檢測結果匯報應準確、清楚和客觀；定性測定匯報“陰性”或“陽性”；定量測定則以拷貝數(shù)/ml或IU/ml匯報；防止二者之間混同；每份匯報應包含以下信息：標題、唯一標識、檢測標本說明、標本特征和狀態(tài)、標本接收日期和檢測日期、檢測方法、檢測和校核人員簽字及發(fā)出日期、參考結果或范圍；如對匯報有效性有疑問，試驗室應馬上通知臨床相關科室給予更正程序；有匯報發(fā)放程序：用電話、傳真、電子郵件匯報結果時保密標準。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第37頁質量控制試驗室應有室內(nèi)質量控制標準操作程序

質控物起源、濃度、批號陰性質控設置所選擇統(tǒng)計質控方法（均值、SD怎樣得到）失控判斷標準失控以后怎么辦試驗室應參加室間質量評價。臨床PCR試劑盒的選用和質檢第38頁抱怨試驗室應制訂埋怨及其處理SOP；

可操作性、不一樣埋怨處理如埋怨包括到工