考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座

1.限制酶選擇標準考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第1頁（1）依據(jù)目標基因兩端限制酶切點確定限制酶種類①應選擇切點位于目標基因兩端限制酶，方便將目標基因“切出”，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點位于目標基因內(nèi)部限制酶，以防破壞目標基因，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為防止目標基因和質(zhì)粒本身環(huán)化和隨意連接，也可使用不一樣限制酶切割目標基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst

Ⅰ和EcoRⅠ兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶切點），而且這種切點不致于破壞全部“標識基因”以及開啟子和終止子?？键c加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第2頁（2）依據(jù)質(zhì)粒特點確定限制酶種類考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第3頁①所選限制酶要與切割目標基因限制酶相一致，以確保含有相同黏性末端。②質(zhì)粒作為載體必須具備標識基因等，所以所選擇限制酶盡可能不要破壞這些結(jié)構(gòu)，應最少含有一個完好標識基因，如圖乙中限制酶pst

Ⅰ因其會破壞標識基因而不宜選擇。③所選限制酶切點不應位于復制原點處以防破壞復制原點，假如所選酶切點不止一個，則切割重組后可能會丟失一些片段，若丟失片段含復制原點區(qū)，則切割重組后片段進入受體細胞后不能自主復制?？键c加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第4頁④所選限制酶，其切點應位于開啟子與終止子之間，如圖乙中HindⅢ會破壞開啟子，EcoRⅠ會破壞終止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出切口可讓目標基因嵌入開啟子與終止子之間。（3）參考Ti質(zhì)粒T－DNA片段選擇限制酶若質(zhì)粒上標出T－DNA片段，則所選限制酶切點應位于T－DNA片段中，從而有利于將目標基因嵌入到T－DNA片段上——因為Ti質(zhì)粒T－DNA片段最易轉(zhuǎn)移至受體細胞而且整合到受體細胞染色體DNA上，如用兩種限制酶Xba

Ⅰ和Sac

Ⅰ（兩種酶切出黏性末端不一樣）切割某DNA，取得含目標基因片段。若利用該片段構(gòu)建基因表示載體，則下列圖中甲、乙、丁，Ti質(zhì)粒均不宜選擇，而丙Ti質(zhì)粒宜選取。（分析以下）考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第5頁考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第6頁2.目標基因檢測與判定

（1）界定“標識基因”與“DNA分子雜交技術”在目標基因檢測中作用： ①載體上標識基因標識原理

載體上標識基因普通是一些抗生素抗性基因。目標基因要轉(zhuǎn)入受體細胞沒有抵抗相關抗生素能力。當含有抗生素抗性基因載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內(nèi)表示，使受體細胞能夠抵抗對應抗生素，所以在受體細胞培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就能夠只保留轉(zhuǎn)入載體受體細胞，倘若在選擇培養(yǎng)基中不能存活，則表明無質(zhì)粒轉(zhuǎn)入，當然不會有“目標基因”轉(zhuǎn)入，能存活時必含該載體，原理以下列圖所表示：考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第7頁②“標識基因”篩選后為何還需應用“DNA分子雜交技術”確認目標基因是否轉(zhuǎn)入？經(jīng)上述步驟篩選得到受體細胞，只是含特定標識基因質(zhì)粒，然而，該質(zhì)粒上是否成功嵌入了目標基因，還不能確定，故仍需使用“目標基因”作探針，利用DNA分子雜交技術，檢測受體細胞質(zhì)粒上是否含目標基因?？键c加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第8頁（2）使用“目標基因”作探針，利用“分子雜交技術”檢測目標基因是否轉(zhuǎn)錄出特定mRNA。（3）采取“抗原—抗體雜交技術”，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)（作抗原）與對應抗體雜交，依據(jù)是否出現(xiàn)雜交帶確認目標基因是否“指導”特定蛋白質(zhì)合成。（4）采取抗蟲、抗病毒等“接種試驗”進行目標基因成功表示“個體生物學”水平檢測?？键c加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第9頁【例證】

（·全國卷Ⅲ，40）圖（a）中三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶識別序列與切割位點，圖（b）為某種表示載體示意圖（載體上EcoRⅠ、Sau3AⅠ切點是唯一）?？键c加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第10頁依據(jù)基因工程相關知識，回答以下問題：（1）經(jīng)BamHⅠ酶切后得到目標基因能夠與上述表示載體被

酶切后產(chǎn)物連接，理由是________________________________________________________。（2）若某人利用圖（b）所表示表示載體取得了甲、乙、丙三種含有目標基因重組DNA分子，如圖（c）所表示，這三種重組DNA分子中，不能在宿主細胞中表示目標基因產(chǎn)物有

，不能表示原因是_______________________________?？键c加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第11頁圖（c）（3）DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來酶，常見有

和

，其中既能連接黏性末端又能連接平末端是_________________________________。考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第12頁[慧眼識圖獲取信息]（1）三種限制酶切割結(jié)果分析考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第13頁（2）表示載體與重組DNA分子分析考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第14頁答案（1）Sau3AⅠ兩種酶切割后產(chǎn)生片段含有相同黏性末端（2）甲、丙甲中目標基因插入在開啟子上游，丙中目標基因插入在終止子下游，二者目標基因均不能被轉(zhuǎn)錄（3）E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第15頁1.（·湖南長沙長郡中學月考）下列圖是利用工程菌（大腸桿菌）生產(chǎn)人生長激素試驗流程。所用pBR322質(zhì)粒含有限制酶Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ切點各一個，且三種酶切割形成末端各不相同，而Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因。請回答以下相關問題：考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第16頁（1）過程①所用到組織細胞是

，過程④所用酶是

。⑤過程慣用

溶液處理大腸桿菌。（2）經(jīng)②過程得到互補DNA片段，稱為

。（3）假如用限制酶Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ對圖中質(zhì)粒進行切割，用一個酶、兩種酶和三種酶分別切割時形成DNA片段種類與用一個酶和兩種酶分別切割時形成DNA片段種類

（填“相同”或“不一樣”），這些種類DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因DNA片段和四環(huán)素抗性基因DNA片段分別有

種和

種?？键c加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第17頁（4）假如只用限制酶Pst

Ⅰ切割目標基因和質(zhì)粒，完成過程④、⑤后（受體大腸桿菌不含Ampr、Tetr），將三角瓶內(nèi)大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取培養(yǎng)基甲上單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養(yǎng)基相同位置上，一段時間后，菌落生長情況如圖乙、丙所表示。接種到甲培養(yǎng)基上目標是篩選

大腸桿菌；接種到培養(yǎng)基乙上大腸桿菌菌落，能存活大腸桿菌體內(nèi)導入是

。含有目標基因大腸桿菌在培養(yǎng)基乙和丙上生存情況是_______________________________________________。考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第18頁（5）將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素、四環(huán)素培養(yǎng)基上過程，屬于基因工程基本操作中_______________________________________________________________步驟。該基因工程中pBR322質(zhì)粒徹底水解產(chǎn)物是______________________。解析（1）過程①取得是人生長激素mRNA，所以組織細胞取自人垂體組織細胞；過程④構(gòu)建基因表示載體酶是DNA連接酶；過程⑤將基因表示載體導入大腸桿菌前，慣用CaCl2溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細胞。（2）②過程是人生長素mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA過程。考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第19頁（3）Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶切點分別用1、2、3表示，一個酶酶切時，一共能夠得到3種相同長度片段；兩種酶酶切時，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3－1六種片段；三種酶酶切時，可得到1－2，2－3，3－1三種片段，與前面重復，所以用一個酶、兩種酶和三種酶分別切割時形成DNA片段種類與用一個酶和兩種酶分別切割時形成DNA片段種類相同。這些種類DNA片段中含有完整氨芐青霉素抗性基因DNA片段和四環(huán)素抗性基因DNA片段分別有3種和3種?？键c加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第20頁（4）在甲中能生長是含有四環(huán)素抗性細菌，含有四環(huán)素抗性基因；在乙培養(yǎng)基中能生長是含有四環(huán)素和氨芐青霉素抗性細菌，所以導入是完整pBR322質(zhì)粒或含有Ampr、Tetr質(zhì)粒。與丙相比，乙培養(yǎng)基中少了兩個菌落，說明丙培養(yǎng)基中這兩個菌落中大腸桿菌成功導入了重組質(zhì)粒，而且目標基因插入質(zhì)粒后，破壞了氨芐青霉素抗性基因，使含有目標基因大腸桿菌不能在含有氨芐青霉素乙培養(yǎng)基上生長，但四環(huán)素抗性基因是完好，則含有目標基因大腸桿菌能在含有四環(huán)素丙培養(yǎng)基上生長。考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第21頁（5）將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素、四環(huán)素培養(yǎng)基上過程，屬于基因工程中篩選含目標基因受體細胞步驟。該基因工程中pBR322質(zhì)?；瘜W本質(zhì)是DNA，其徹底水解產(chǎn)物是磷酸、脫氧核糖和四種含氮堿基。答案（1）人垂體組織細胞DNA連接酶CaCl2（2）cDNA（3）相同3

3（4）含四環(huán)素抗性基因完整pBR322質(zhì)粒（或含有Ampr、Tetr質(zhì)粒）在丙中能存活，在乙中不能存活（5）篩選含目標基因受體細胞磷酸、脫氧核糖、四種含氮堿基考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第22頁2.（·河南名校聯(lián)盟調(diào)研）如圖所表示為培育轉(zhuǎn)基因細菌操作流程，回答以下問題：（1）圖中①過程所用工具酶有

。為了預防載體和外源DNA自連，應怎樣操作？______________________________________________。（2）當細菌轉(zhuǎn)化過程中吸收外源DNA是病毒DNA時，該轉(zhuǎn)化過程又稱轉(zhuǎn)染。圖中外源DNA來自

。為了提升轉(zhuǎn)染效率，應使用

處理細菌。（3）圖中②過程，重組DNA增殖時需要哪些條件？_________________。考點加強課限制酶的選擇與目的基因的檢測與鑒定專家講座第23頁（4）圖中③過程，篩選含重組質(zhì)粒細菌需用到

基因功效。已知所用載體內(nèi)有青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因兩種抗性基因，請寫出能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長，但不能在含青霉素培養(yǎng)基上生長細菌即為含外源DNA細菌前提條件：_____________________________________________________________________________________________________________________（答出兩點即可）。解析依據(jù)轉(zhuǎn)染定義可知，