辣椒疫病生防菌的篩選、鑒定及其抑菌機理初探

辣椒疫病生防菌的篩選、鑒定及其抑菌機理初探摘要：采用平板稀釋法和平板對峙試驗，從武漢、荊州、宜昌和荊門等地的辣椒根際土壤中分離到１８５株細菌，篩選到１株具有高效拮抗辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）的生防菌Ｂｓ０４。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)測定、１６ＳｒＤＮＡ序列測定及進化樹構(gòu)建，確定菌株Ｂｓ０４為枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）。Ｂｓ０４對辣椒疫霉菌絲生長抑制率達８０％，同時對煙草黑脛病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａｖａｒ．ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、棉花黃萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ）、棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍf.sb．ｖｅｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）和黃瓜立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）具有明顯的抑制作用。利用光學(xué)顯微鏡觀察Ｂｓ０４對辣椒疫霉菌絲形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)菌絲分支增多、頂端畸形、原生質(zhì)濃縮及生長緩慢等現(xiàn)象，表明Ｂｓ０４具有顯著的抑菌作用。

關(guān)鍵詞 ：辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）；生防菌；鑒定；抑菌機理

中圖分類號：Ｓ４３６文獻標(biāo)識碼：A文章編號：0439－８114（２０15）07－1596-04

DOI:10.14088/jki.issn0439-8114.2024.07.016

辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）引起，是重要的辣椒根莖病害之一，在中國及世界其他國家辣椒生產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴重，給辣椒生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。對于辣椒疫病的防治大多采用化學(xué)防治，而大量使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致了環(huán)境的嚴重污染，對消費者的身體健康產(chǎn)生了不利影響。目前，由于辣椒抗疫病品種較少，且多為中抗或不耐病品種，難以有效地控制辣椒疫病。因此，尋找安全有效的防治措施成為控制辣椒疫病的一個亟待解決的問題。

植物病害的生物防治是利用有益生物和生物代謝產(chǎn)物對植物病害進行有效防治的技術(shù)與方法，具有無毒、無害、無污染和高效等優(yōu)點，受到了研究者的青睞。關(guān)于辣椒疫病的生物防治國內(nèi)外均有相關(guān)研究報道［１－４］，但主要集中在生防菌的防效和應(yīng)用上，對其控病機理研究卻較少。在此基礎(chǔ)上，針對湖北省辣椒疫病發(fā)生嚴重的狀況，本研究從辣椒根際土壤中分離生防菌株，并對其進行鑒定，初步探討生防菌的抑菌機理，為有效地防治辣椒疫病奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１供試菌株和培養(yǎng)基

辣椒疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）、煙草黑脛病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａｖａｒ．ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、棉花黃萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ）、棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍf.sb．ｖｅｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）、黃瓜立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）均由長江大學(xué)生命科學(xué)院實驗室保存。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（ＮＡ）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（ＰＤＡ）。

１．２土樣采集和處理

從武漢、荊州、宜昌和荊門等辣椒種植區(qū)疫病發(fā)生嚴重的田地，利用五點采樣法從生長健康辣椒根際采集土樣。采樣時鏟去表層５ｃｍ土層，取新鮮土樣５００ｇ，用保鮮袋保存。稱取土樣１０ｇ加入裝有９０ｍＬ無菌水的三角瓶中（內(nèi)裝玻璃珠若干），３０℃、１２０ｒ／ｍｉｎ振蕩３０ｍｉｎ，靜置后獲得土壤懸液。

１．３生防細菌的篩選

將土壤懸液稀釋成１０－５、１０－６、１０－７濃度，吸取不同稀釋度的土壤懸液１００μＬ涂布于ＮＡ培養(yǎng)基上，置于２８℃培養(yǎng)４８ｈ，挑取顏色、形態(tài)等不同的細菌單菌落并純化、保存。采用平板對峙法測定分離到的細菌對辣椒疫霉的抑菌活性。將辣椒疫霉菌在ＰＤＡ平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊（直徑６ｍｍ），接種到ＰＤＡ平板中央。培養(yǎng)１ｄ后，在距離辣椒疫霉菌塊２ｃｍ處的４個對接點接種待測細菌，２８℃培養(yǎng)，５ｄ后觀察抑菌結(jié)果，每個處理設(shè)３次重復(fù)。

１．４拮抗菌株的鑒定

將篩選到的抑菌效果較好的菌株進行菌落形態(tài)觀察、顯微形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、水解淀粉試驗、甲基紅試驗（Ｍ．Ｒ）、Ｖ．Ｐ試驗、檸檬酸鹽試驗、接觸酶反應(yīng)試驗、明膠液化試驗、運動性試驗等主要形態(tài)和生理生化指標(biāo)鑒定［５，６］。參照文獻［７］方法提取疑似枯草芽孢桿菌基因組ＤＮＡ。根據(jù)已報道的枯草芽孢桿菌１６ＳｒＤＮＡ的保守區(qū)序列設(shè)計引物ＢｓＦ（５′－ＴＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ－３′）和ＢｓＲ（５′－ＧＧＧＴＴＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧ－３′），以枯草芽孢桿菌疑似株基因組為模板，進行ＰＣＲ擴增。ＰＣＲ反應(yīng)程序為：９４℃預(yù)變性４ｍｉｎ；９４℃變性１ｍｉｎ，５４℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３０個循環(huán)；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后測序，將測序結(jié)果與ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中的序列進行對比分析，利用ＭＥＧＡ４．１軟件構(gòu)建進化樹。

１．５拮抗菌株的抑菌譜試驗

拮抗菌對各試驗病原真菌的拮抗作用均采用平板對峙法，各試驗重復(fù)３次。２８℃下培養(yǎng)５ｄ后，測量抑菌帶的寬度和菌落半徑，計算拮抗菌對病原真菌生長的抑制率。對病菌生長的抑制率＝（對照菌落半徑－處理菌落半徑）／對照菌落半徑×１００％。

１．６拮抗菌株對辣椒疫病菌菌絲形態(tài)的影響

將辣椒疫病菌在ＰＤＡ培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)３ｄ后，用打孔器打取直徑５ｍｍ的菌塊置于盛有２０ｍＬＰＤA培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，２８℃培養(yǎng)２ｄ。將培養(yǎng)好的辣椒疫病菌菌塊分別用拮抗菌株的無菌培養(yǎng)濾液和菌體懸浮液處理２４ｈ后，以無菌水處理為對照，挑取菌絲在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，每處理重復(fù)３次。

２結(jié)果與分析

２．１拮抗細菌的篩選結(jié)果

從健康辣椒根際土壤中共分離到１８５株細菌，從中挑取菌落形態(tài)、顏色與枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）相似的細菌４８株。采用平板對峙法測定上述４８株細菌的抑菌活性，結(jié)果表明有２９株能夠抑制辣椒疫霉的生長，但抑菌程度不同。其中抑菌圈直徑為７．０～８．０ｍｍ的有１株，為５．０～７．０ｍｍ的有６株，為３．０～５．０ｍｍ的有２２株。編號為Ｂｓ０４的菌株抑菌效果最強（圖１）。

２．２拮抗菌株Ｂｓ０４的鑒定結(jié)果

２．２．１形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)菌株Ｂｓ０４在ＮＡ平板上培養(yǎng)２ｄ后，菌落圓形或橢圓形，乳白色，中央凹陷，表面干燥，有褶皺，不透明。菌體為桿狀，大小為（０．７~０．８）μｍ×（２．０~３．０）μｍ，革蘭氏染色陽性，其他生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果見表１。

２．２１６ＳｒＤＮＡ序列與同源性分析以拮抗菌株Ｂｓ０４的基因組ＤＮＡ為模板，用ＢｓＦ和ＢｓＲ為引物，進行ＰＣＲ擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到１條大小約１５００ｂｐ的清晰條帶（圖２），測序結(jié)果為１５３８ｂｐ。將測序結(jié)果在ＮＣＢＩＧｅｎBａｎｋ上進行序列比對（比對號ｌｃｌ２８０１７），發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌１６ＳｒＤＮＡ序列的相似性高達９９％，初步確定拮抗菌株Ｂｓ０４為枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）。將菌株Ｂｓ０４的１６ＳｒＤＮＡ序列上傳ＧｅｎBａｎｋ，獲得基因序列號ＫＦ７２５６３６，并利用ＭＥＧＡ４．１軟件進行聚類分析，構(gòu)建進化樹。由圖３可知，Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＫＦ７２５６３６）與Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＫＣ５０６７７８．１）處于一個小分支，同時與另外兩個枯草芽孢桿菌位于一個大分支。由此，進一步表明拮抗菌株Ｂｓ０４為枯草芽孢桿菌。

２．３對其他病原真菌的拮抗作用

為了研究拮抗菌株Ｂｓ０４的生防潛力，采用平板對峙法對其抑菌譜進行了測定。結(jié)果表明，拮抗菌株Ｂｓ０４對供試病原真菌有較高的拮抗活性。由表２可知，拮抗菌株Ｂｓ０４對辣椒疫霉菌、煙草疫霉菌的抑制率達７０％以上，對其他病原真菌的抑制率也在４０％以上。表明菌株Ｂｓ０４的抑菌譜寬，生防潛力較大，具有良好的應(yīng)用前景。

２．４對辣椒疫霉菌菌絲形態(tài)的影響

由圖４可知，用去離子水處理的辣椒疫霉菌絲形態(tài)飽滿，細胞壁光滑，菌絲能正常生長并擴展（圖４ａ）。經(jīng)拮抗菌株Ｂｓ０４菌體懸浮液和無菌濾液處理后，辣椒疫霉菌絲形態(tài)發(fā)生明顯變化，菌絲分支增多，頂端出現(xiàn)畸形，生長緩慢（圖４ｂ與圖４c）；大多數(shù)菌絲還出現(xiàn)了細胞壁加厚，原生質(zhì)濃縮呈球形或橢圓形的現(xiàn)象，菌絲中間出現(xiàn)許多類似厚壁孢子的細胞（圖４d）。

３小結(jié)與討論

近年來，辣椒疫病發(fā)生日益嚴重，給中國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了較大的危害。對于辣椒疫病的防治，長期以來使用化學(xué)農(nóng)藥進行防治，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留污染、增強病原菌的抗藥性等不利影響。辣椒疫病作為典型的土傳病害，應(yīng)用生防菌對其進行防治則顯得至關(guān)重要。芽孢桿菌是一類重要的用于土傳性病害的生防細菌。多粘類芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌［８］等能夠抑制多種病原菌的生長，對其引起的病害起到一定的防治作用。

枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，具有生長快、營養(yǎng)要求簡單、對人畜無害、能夠抑制多種植物病害、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是目前應(yīng)用廣泛的生防菌［９］?？莶菅挎邨U菌能夠有效抑制玉米串珠鐮孢菌［１０］、棉花枯萎病菌［１１］、稻瘟病菌［１２］等，其抗菌譜較廣。本研究通過平板稀釋法從辣椒根際土壤中分離到了枯草芽孢桿菌Ｂｓ０４，采用平板對峙法發(fā)現(xiàn)其對辣椒疫霉菌具有較強的拮抗作用，且對其他多種病原真菌具有明顯的抑菌作用，具有較廣的抗菌譜，這與前人的研究結(jié)果一致［１３－１５］。同時，枯草芽孢桿菌Ｂｓ０４顯著影響辣椒疫霉菌絲形態(tài)，能抑制菌絲的生長和擴展，阻止病原菌的進一步侵染?？莶菅挎邨U菌作為目前應(yīng)用較為廣泛的生防細菌之一，其主要通過根際定殖、分泌抗生素及拮抗蛋白等達到防病目的。本研究中菌株Ｂｓ０４的防病機理有待進一步研究，而對于其在生產(chǎn)上的應(yīng)用效果還有待于深入探索。

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