病毒清除工藝驗證探討及中外法規(guī)解讀

病毒清除工藝驗證探討及中外法規(guī)解讀北京義翹神州科技股份有限公司目錄生物制品病毒安全性控制1病毒清除驗證2國內(nèi)、外法規(guī)3問題解析4義翹神州生物制品病毒安全性控制01義翹神州中國法規(guī)變更義翹神州中國法規(guī)變更義翹神州中國藥典2020年版三部指導(dǎo)原則范圍：生物制品生物制品：以微生物或人/動物源的細胞、組織和體液等為起始原材料，其制備過程或制劑中可能添加人或動物來源的原材料或輔料，這些起始原材料、輔料潛在的病毒污染是影響產(chǎn)品安全性的關(guān)鍵因素。藥典-生物制品病毒安全性控制義翹神州藥典-生物制品病毒安全性控制一般原則風(fēng)險評估分類要點周期管理全程控制人血液制品動物來源制品疫苗重組治療性生物制品基因治療產(chǎn)品人血漿來源風(fēng)險控制病毒清除能力起始原料風(fēng)險控制病毒清除能力病毒污染來源控制病毒污染來源控制病毒清除能力病毒污染來源控制義翹神州來源控制1、起始原料：參考P8，P11，P21，P60，通則36012、原材料輔料：參考P5病毒清除工藝驗證1、一般要求2、檢測方法3、病毒清除效果的評估4、統(tǒng)計分析5、工藝變更對病毒清除的影響生產(chǎn)過程控制1、產(chǎn)品生產(chǎn)工藝2、特定病毒清除工藝步驟產(chǎn)品病毒污染的檢測1、病毒污染檢測設(shè)置的原則2、病毒污染檢測方法的選擇具體要求藥典-生物制品病毒安全性控制義翹神州Q5A(R1)Step4指導(dǎo)原則的范圍：體外細胞培養(yǎng)物所提取的產(chǎn)品，如干擾素、單抗和重組DNA產(chǎn)品（包括重組亞單位疫苗），也包括從體內(nèi)腹水內(nèi)培養(yǎng)的雜交瘤細胞中的提取產(chǎn)品。不包含滅活疫苗，含有自我復(fù)制因子的所有滅活疫苗以及基因工程活載體產(chǎn)品。ICHQ5A-病毒安全性評價控制生物技術(shù)產(chǎn)品潛在的病毒污染的三個原則：1、對細胞系和其他原料，包括各種培養(yǎng)基、進行選擇和測試，確保其不含可能對人有感染和或致病作用的病毒；2、對生產(chǎn)工藝中清除感染性病毒的能力進行評估；3、在生產(chǎn)的適當(dāng)步驟對產(chǎn)品進行測試，確保產(chǎn)品沒有受感染性病毒的污染。義翹神州ICHQ5A-病毒安全性評價分類評價：CaseA：未發(fā)現(xiàn)有病毒、病毒樣顆粒。CaseB

：只有嚙齒類動物逆轉(zhuǎn)錄病毒。CaseC

：含有已知的但對人無感染的病毒。CaseD：含有已知的人致病原。CaseE：含有未知的病毒，可能對人有致病性。義翹神州ICHQ5A-病毒安全性評價病毒清除驗證02義翹神州病毒清除驗證----何時做？工藝研發(fā)階段（Optional）新藥臨床申請（IND）（Compulsory）上市許可申請（BLA）（Compulsory）上市后產(chǎn)品補充驗證（Optional）義翹神州病毒清除驗證----如何做？除病毒過濾低pH孵育層析病毒加到樣品細胞檢測qPCR檢測義翹神州添加病毒總量殘余病毒總量計算差值國內(nèi)、外法規(guī)03義翹神州國內(nèi)、外法規(guī)-----①指示病毒義翹神州ICHQ5A相關(guān)病毒、特異性“模型”病毒、非特異性“模型”病毒一方面需要對清除已知病毒的工藝做出評價，一方面還需要用非模型病毒評價該工藝的耐用性嚙齒類動物細胞系一般含有逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；蚰孓D(zhuǎn)錄病毒樣顆粒，生產(chǎn)工藝應(yīng)該能夠去除滅活逆轉(zhuǎn)錄病毒，可用鼠白血病病毒進行驗證，鼠白血病病毒是鼠細胞特異模型病毒FDA選擇合適的一種或多種病毒。要使用已知或懷疑會污染細胞系的病毒，也可選擇相似的模型病毒當(dāng)一種病毒不能為該過程的充分性提供足夠的證明，需要使用一種以上的病毒EMEA相關(guān)病毒、模型病毒首先盡可能選擇最可能污染產(chǎn)品的相似的病毒進行驗證。其次，盡可能代表各種物理化學(xué)性質(zhì)，以便全面驗證系統(tǒng)去除病毒的能力中國《一般原則》2005：一個典型的驗證研究所選擇的病毒，至少應(yīng)包括單鏈和雙鏈的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、強和弱抵抗力、大和小顆粒等病毒《中國藥典》2020：相關(guān)病毒、特異性“模型”病毒、非特異性“模型”病毒，按順序選擇指示病毒的選擇義翹神州國內(nèi)、外法規(guī)-----②可重復(fù)性研究義翹神州ICHQ5A至少分別做兩次獨立的研究來證實清除的可重復(fù)性FDA驗證性研究應(yīng)重復(fù)進行，并評估研究內(nèi)和研究間的統(tǒng)計差異。EMEA一個有效的病毒去除步驟的重復(fù)性至少應(yīng)該進行兩次獨立的實驗進行證實中國《一般原則》2005：一個有效的工藝步驟實際上應(yīng)當(dāng)在兩個獨立的驗證研究中都能夠重復(fù)出相同的病毒去除/滅活量。國內(nèi)、外法規(guī)-----③滅活動力學(xué)義翹神州ICHQ5A病毒滅活不是一個簡單的一次性反應(yīng)，有快的“一期”反應(yīng)和慢的“一期”反應(yīng)。要在不同時間取樣，并建立滅活曲線。建議在零至最低作用時間內(nèi)設(shè)點。FDA應(yīng)確定病毒在滅活步驟臨界點的滅活動力學(xué)。EMEA測量到的病毒滴度降低只是一個保守的評估。病毒滅活不是一個簡單的一級反應(yīng)，經(jīng)常伴隨一個快速的初始反應(yīng)，而后是一個緩慢的過程。然而，隨著時間的推移，滅活率的急劇下降可能表明滅活劑的效力喪失，或殘留的病毒組分對滅活劑具有抗性，并意味著這一步驟既不是高度有效也不可靠。應(yīng)在不同時間采集樣品，并構(gòu)建滅活曲線。中國《一般原則》2005：病毒去除/滅活過程不是簡單的一級動力學(xué)反應(yīng)過程，病毒滅活一般先經(jīng)過快速下降期，然后轉(zhuǎn)入緩慢下降期的雙時相特征。病毒滅活具有時間依賴性，因此加入只是病毒的中間產(chǎn)品，應(yīng)在特定的緩沖液或?qū)游鲋斜Ａ糇銐虻臅r間，以充分模擬實際生產(chǎn)工藝條件?！吨袊幍洹?020：通過滅活速率和滅活曲線國內(nèi)、外法規(guī)-----④縮小模型義翹神州ICHQ5A應(yīng)對縮小生產(chǎn)規(guī)模的有效性加以證實。如色譜純化工藝，選擇的色譜設(shè)備，柱床型號、線性流速、流速/柱床高度比、緩沖液、凝膠型號、PH、溫度、蛋白濃度、鹽及產(chǎn)品應(yīng)代表生產(chǎn)工藝水平。

要求對工藝參數(shù)做出評價FDA應(yīng)準(zhǔn)確反應(yīng)實際工藝，柱床大小、流速、流速/柱床高度比、緩沖液、緩沖液類型、PH、蛋白濃度、鹽及產(chǎn)品濃度應(yīng)代表生產(chǎn)工藝水平。EMEA縮小工藝模型與實際生產(chǎn)工藝的可比性是縮小工藝模型對生產(chǎn)工藝病毒評價結(jié)果可接受的前提條件。通過比較工藝參數(shù)如PH，溫度，蛋白濃度，其它成分，反應(yīng)時間，柱床高度，線性流速等，對縮小工藝模型進行論證。中國應(yīng)對縮小生產(chǎn)規(guī)模的有效性加以證實。如色譜純化工藝，選擇的色譜設(shè)備，柱床高度、線性流速、流速/柱床高度比、緩沖液、凝膠型號、PH、溫度、蛋白濃度、鹽及產(chǎn)品應(yīng)代表生產(chǎn)工藝水平。雖然有些偏差是不可避免的，但應(yīng)對實驗結(jié)果可能產(chǎn)生的影響給予合理的解釋。國內(nèi)、外法規(guī)-----⑤檢測方法義翹神州ICHQ5A感染性定量分析應(yīng)該具有足夠的敏感性和重復(fù)性，具有足夠的重復(fù)實驗確保結(jié)果具有充分的統(tǒng)計學(xué)可信度。如有正當(dāng)理由，可使用與感染性無關(guān)的定量分析。內(nèi)部變異的95%可信限一般應(yīng)該在均值的+0.5log10。FDA用來定量病毒滴度的感染性分析方法應(yīng)該是靈敏的、可重復(fù)的。應(yīng)保證足夠的樣品量，盡可能檢測到病毒。檢測變異性應(yīng)在感染性分析中確定，并使用置信區(qū)間。內(nèi)部變異的95%可信區(qū)間，并應(yīng)該在均值的+0.5log10。EMEA感染性定量分析應(yīng)該遵循GLP的要求，這些方法應(yīng)該具有足夠的敏感性和重復(fù)性，具有足夠的重復(fù)實驗確保結(jié)果具有充分的統(tǒng)計學(xué)可信度。PCR檢測方法只能用于病毒去除檢測，不能評價病毒滅活效果。用于病毒檢測的分析方法的適用性應(yīng)得到驗證。中國應(yīng)盡可能選擇靈敏度高的病毒檢測方法，以確保對滅活效果的準(zhǔn)確判定。用于病毒清除研究的檢測方法應(yīng)經(jīng)評估，評估包括靈敏度、特異性、重復(fù)性、緩沖液/基質(zhì)對病毒感染力的干擾、可能影響選用指示病毒對細胞感染能力的產(chǎn)品及緩沖液的細胞毒性分析等。常用病毒檢測方法可采用病毒含量或滴度檢查（包括蝕斑形成試驗和細胞病變法）或定量病毒核酸檢測相關(guān)技術(shù)。國內(nèi)、外法規(guī)-----⑥檢測影響評估義翹神州ICHQ5A應(yīng)分別單獨評價緩沖液和制品在病毒滴度檢測方法中的毒性和干擾作用。FDA應(yīng)單獨評估緩沖液和樣品在病毒滴度檢測方法中的毒性和干擾。EMEA樣品對檢測結(jié)果的影響包括樣品毒性影響，應(yīng)該記錄樣品的檢測限度。中國《一般原則》2005：應(yīng)分別單獨評價緩沖液和制品在病毒滴度檢測方法中的毒性和干擾作用?！吨袊幍洹?020：應(yīng)評估緩沖液和產(chǎn)品自身對指示病毒的毒性作用或?qū)Σ《镜味葯z測方法的干擾作用國內(nèi)、外法規(guī)-----⑦實驗環(huán)境義翹神州ICHQ5A根據(jù)GMP規(guī)定，不能將任何病毒引入生產(chǎn)設(shè)備，因此病毒清除研究應(yīng)在隔離的實驗室進行。FDA驗證通常需在生產(chǎn)設(shè)施外進行，以防止可能的病毒污染。EMEA根據(jù)GMP要求，不能故意引入任何病毒進入生產(chǎn)設(shè)施。因此，驗證應(yīng)在一個單獨的實驗室進行，該實驗室配備了用于縮小生產(chǎn)工藝的病毒學(xué)工作的設(shè)備，并具有病毒學(xué)專業(yè)知識的人員，應(yīng)按GLP原則進行。中國驗證通常是在非生產(chǎn)現(xiàn)場的特性實驗室進行。應(yīng)當(dāng)配備適于開展病毒研究工作的相應(yīng)試驗條件和設(shè)備，試驗人員應(yīng)具有必要的病毒學(xué)試驗專長。國內(nèi)、外法規(guī)-----⑧假性病毒衰減義翹神州ICHQ5A應(yīng)進行平行對照分析研究，以評估樣品是否因稀釋、濃縮、過濾、儲存等原因使病毒失去感染性。FDA研究應(yīng)包括與實驗條件平行進行的對照，以評估實驗操作（稀釋、濃縮、過濾、儲存等）引起的病毒滅活。EMEA如果可能，模型樣本中加入病毒后直接進行滴度測定，而不應(yīng)該進行進一步的操作，例如超速離心、層析或儲存。驗證工作應(yīng)包括平行對照分析，以評估由于滴定前樣品稀釋或儲存等原因造成的病毒感染性喪失。中國《一般原則》2005：應(yīng)設(shè)立充分的平行對照試驗，說明試驗本身及樣本制備過程，提供相關(guān)的試驗資料，以排除由于樣本的透析、稀釋、濃縮、過濾及貯藏可能對去除/滅活驗證效果的影響。《中國藥典》2020：樣品應(yīng)盡快并盡可能直接進行病毒滴定，如果做進一步處理，或不同時間取出的樣品要放置一段時間一同檢測，應(yīng)設(shè)立平行對照。國內(nèi)、外法規(guī)-----⑨互補機制義翹神州ICHQ5A可采用將幾種互補分離過程結(jié)合的方法或?qū)⒉《緶缁钆c分離相結(jié)合的方法均能達到有效清除病毒的目的FDA不同步驟的病毒下降因子是獨立的，應(yīng)具有不同的作用機制，從而使病毒逃脫一個步驟，同時逃脫另一個步驟的可能性不高。當(dāng)已知傳染性病毒經(jīng)常出現(xiàn)在未經(jīng)純化的產(chǎn)品中時，建議病毒清除工藝中至少含有一個病毒滅活步驟。EMEA驗證一個以上的的病毒清除工藝步驟是可取的，至少應(yīng)評估兩個正交步驟，正交步驟被定義為不同機制的病毒清除步驟。中國《一般原則》2005：生物組織提取制品應(yīng)包含兩種從機制上能夠互補的有效工藝步驟，至少一個處理步驟應(yīng)該具有針對非脂包膜病毒去除和/或滅活效應(yīng)，對于真核細胞表達應(yīng)至少包括一個有效工藝步驟，并能夠有效去除和/或滅活非脂包膜病毒。國內(nèi)、外法規(guī)-----⑩病毒清除原理義翹神州ICHQ5A對評定的每一個工藝，都應(yīng)說明其減少病毒感染性的機制是去除還是滅活。FDA在可行的情況下，應(yīng)通過明確哪部分病毒是由于病毒滅活，哪部分病毒是由于物理作用去除來確定純化工藝對病毒清除的貢獻。EMEA只要有可能，應(yīng)說明病毒感染性的降低是通過病毒滅活還是病毒顆粒的去除來實現(xiàn)的。中國應(yīng)明確病毒清除機制，并依據(jù)病毒特性選擇適宜的病毒清除工藝。國內(nèi)、外法規(guī)-----?使用后填料及清潔義翹神州ICHQ5A分離柱重復(fù)使用，應(yīng)該在多次使用后提供病毒去除穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)支持?？赏ㄟ^提供證據(jù)證實色譜柱經(jīng)過清洗和再生過程確實將病毒滅活或消除。FDA應(yīng)考慮隨著時間的推移，色譜柱在重復(fù)使用后清除病毒的能力可能會有所不同。EMEA在重新使用該系統(tǒng)前應(yīng)該確保工藝系統(tǒng)內(nèi)潛在病毒殘留已經(jīng)被充分去除，例如通過對柱子的消毒等。中國應(yīng)考慮反復(fù)使用的新層析柱與反復(fù)使用的舊柱對比去除病毒效果的差別法規(guī)中其他方面義翹神州如何評估？1、具有相同作用機制的兩個步驟的下降因子不能相加，例如：低pH作用2、＜1log10的下降因子，不能計入總的清除效果中。3、未純化的原料中對逆轉(zhuǎn)錄病毒進行檢查，可用電鏡法，檢測下限是1×106/ml。4、整個純化工藝病毒清除下降因子應(yīng)遠大于最終產(chǎn)品單次使用劑量的起始材料中存在的假定病毒量。大于的數(shù)量取決于所關(guān)注的病毒和產(chǎn)品的預(yù)期用途。病毒安全性評估計算舉例：1、收獲液檢測的病毒量=106/ml2、每劑量使用的收獲液體積=10ml3、每劑量可能含有的病毒=106/ml*10ml=1074、小鼠白血病病毒清除下降因子總和≥10115、評估=107/1011=-104每一萬份劑量中少于1個病毒。義翹神州問題解析04義翹神州Q2：指示病毒如何選擇？A2：a.優(yōu)先選擇表格中用過的病毒；b.只對有效果的工藝進行；c.根據(jù)產(chǎn)品性質(zhì)，選擇最適合的病毒；d.模式病毒，并不強制使用。病毒清除工藝驗證問題解析義翹神州Q1：方案如何確定？A1：滅活+層析+納濾

滅活：低pH、表面活性劑、乙醇、強堿

層析：去除效果好的一步，效果不好的兩步；IND階段只做關(guān)鍵病毒，BLA階段全做。

納濾：能加則加Q4：樣品滿足什么條件？A4：a.驗證工藝的待上樣樣品（過程樣），不能只是收獲液；b.GMP生產(chǎn)條件下；c.規(guī)模盡量與生產(chǎn)規(guī)模接近；d.工藝驗證、臨床批、藥理毒理。Q5：是否需要委托方或工程師參與層析？A5：優(yōu)先客戶參與層析步驟，以免細節(jié)不到位或遇到問題不能及時處理。優(yōu)先納濾廠家工程師參與，經(jīng)驗豐富，及時處理問題。病毒清除工藝驗證問題解析Q3：驗證批次？A3：一批重復(fù)兩次。更多批次驗證接受度更高。義翹神州病毒清除工藝驗證問題解析Q8：義翹平臺優(yōu)勢？A8：有3個中外雙報報成功案例，有20多個國內(nèi)成功案例包含BLA和IND，驗證周期快，服務(wù)態(tài)度好，價格合理。1）驗證儀器均為AKTA，經(jīng)過驗證和校準(zhǔn)，項目完成做深層清潔；2）生物二級實驗室，保證生物安全；3）獨立的驗證室和客戶辦公室，保證客戶隱私；4）如驗證遇到問題，積極幫助客戶解決，以客戶利益為先；5）有專門的對接客戶的實驗人員，避免溝通不暢，提升服務(wù)質(zhì)量；6）儀器多，通量大，可同時開展5個項目。IND最快3天，BLA最快2周完成層析驗證；7）有細胞庫檢測業(yè)務(wù)，可打包服務(wù)降低成本。義翹神州Q7：驗證周期多久，是否需要排隊？A7：IND最快2個月。義翹目前可不用排期。病毒清除驗證----縮小模型準(zhǔn)備？滅活pH值、SD濃度（生產(chǎn)范圍）滅活溫度滅活時間委托方提供層析柱子直徑(0.5-1.6cm)柱高一致柱體積上樣載量線性流速一致上樣洗脫條件一致曲線類似性產(chǎn)品收率委托方提供納濾品牌驗證用膜面積生產(chǎn)通量挑戰(zhàn)通量過濾壓力膜潤洗體積壓力中斷委托方提供義翹神州病毒清除驗證----準(zhǔn)備？驗證目的初步病毒驗證需求明確目的（研發(fā)？申報？）明確產(chǎn)品類型1溝通方案驗證目的確認能力工藝病毒的選擇層析和納濾人員方案報價確